DIFERENCIACE


Diferenciace je rozrůznění buněk do specifických typů během vývoje organismu nebo při obnovování
tkání.

K obnovným buněčným populacím v dospělém organismu patří krvetvorná tkáň, epitel střeva, epitel
kůže, zárodečná tkáň.


Během diferenciace

•         se mění morfologie buněk

•         stoupá aktivita specifických enzymů (např. alkalické fosfatázy) – např. epiteliální buňky
střeva

•         stoupá exprese specif. povrchových antigenů (CD11b, CD 14) – např. krevní buňky

•         vzniká schopnost fagocytózy a produkce kyslíkových radikálů (měření redukce NBT nebo
chemiluminiscenčně) – např. buňky imunitního systému

•

MĚŘENÍ DIFERENCIACE EPITELIÁLNÍCH BUNĚK


Buněčná linie odvozená z ………………………………………byla kultivována na 40 mm kultivačních miskách v inkubátoru
při teplotě …….., vlhkosti…….. a ….. CO[2.]

Buňky byly indukovány do diferenciace, jejíž úroveň byla následně stanovena jako …………………………………………..

Vzorky:

Buněčná linie: ………….

Ovlivněná: ………….

Čas: ………


Alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4-p-nitrofenyl fosfát za vzniku žlutého zbarvení, které
je detekováno …………………………

Intenzita zbarvení odpovídá množství alkalické fosfatázy ve vzorku.


potřebujeme:
  * substrátový pufr
  * 4-p-nitrophenylphosphate ředěný 2mg/1ml substrátového pufru
  * ALP ss 5U/ml
  * 3mM NaOH


pracovní postup:   potřebujeme 0,5 . 10^6 buněk


-stočit (200G/5min) a odsát médium (v tomto kroku je možné pelet zamrazit a pokračovat jindy)

-opláchnout substrátovým pufrem

-pelet rozpipetovat v 500ml substrátového pufru a dát na led

-sonikovat 5x10s (s mezichlazením) při nastavení 1 (25W)

-stočit

-vzorky nakapat do jamek (96-jamková deska) po 50ml

-stejně nakapat i blank (substrátový pufr) a kalibrační křivku (ředění ALP)

-přidat do jamek 50ml substrátu (4-p-nitrophenylphosphate - ředěný 2mg/1ml substrátového pufru)

-inkubovat 30min v 37°C

-přidat 50ml 3mM NaOH

-změřit absorbanci na přístroji Fluostar při 405nm


Ředění pro kalibrační křivku:

-         zásobní roztok ALP 5U/ml = 0,25U/50ul  ředit 250x substrátovým pufrem (do 500ul dát 2ul
ALP) a dostanu 0,001U/50ul. Dále ředit substrátovým pufrem 1:1 :

               0,0005U/50ml

               0,00025U/50ml

               0,000125U/50ml

               0,0000625U/50ml

               0,00003125U/50ml

               0,000015625U/50ml


Substrátový pufr:

- rozpustit 10,05ml diethanolaminu v 70ml destilované vody

- nastavit pH na 9,7

- navážit 0,1016g MgCl[2].6H[2]O a rozpustit ho v 10ml destilované vody

- smíchat s diethanolaminem a dlouho míchat

- doředit destilovanou vodou na 100ml



Výsledky: