Moderní metody buněčné biologie 2015


Separace živých a mrtvých buněk HEK 293 pomocí buněčného sorteru

Stanovení viability buněk bývá součástí téměř každého protokolu v oblasti průtokové cytometrie.
Mrtvé buňky nespecificky vážou protilátky a zvyšují tak procento pozitivních buněk při detekci
příslušného markeru. Rozlišení mrtvých a živých buněk je proto klíčové pro správný výpočet
pozitivní a negativní frakce buněk daného markeru. Nejsnáze lze určit mrtvé buňky pomocí značení
Propidium jodidem (PI). PI je fluorescenční látka schopná prostoupit permeabilizovanou (porušenou)
buněčnou membránou a vázat se uvnitř buňky na DNA. U živých buněk je membrána intaktní a PI
membránou v důsledku velikosti molekuly neprochází. Nárůst intenzity fluorescence u mrtvých buněk
je měřen pomocí průtokového cytometru/buněčného sorteru po excitaci laserem o vlnové délce 561 nm,
následně detekujeme emitované fotony v oblasti vlnových délek 600-630 nm. Na buněčném sorteru tak
lze s využitím dalších parametrů (FSC, SSC) odseparovat kompaktní populaci jednotlivých živých
buněk a použít je pro další analýzu.



Vzorek: Adherentní buněčná linie HEK293 (human embryonic kidney)



Příprava suspenze a značení na viabilitu:

1)         Odsát médium z misky

2)         Opláchnout buňky pomocí EDTA/PBS

3)         Odsát EDTA/PBS z misky

4)         Přidat 0,5ml Trypsinu a ponechat max.5 min/37 °C

5)         Inaktivovat Trypsin přidáním 5x množstvím kompletního média se sérem

6)         Stočit 200g/5min

7)         Odsát, rozsuspendovat v PBS+1%BSA a stanovit koncentraci buněk v suspenzi (např. pomocí
počítače buněk)

8)         Připravit suspenzi v koncentraci 1x10^6 buněk/ml média.

9)         Přefiltrovat přes 100μm sterilní filtr

10)       5 min. před měřením přidat do zkumavky Propidium jodid (stock 0,1mg/ml) 1:100 (=značení
na viabilitu)


Schéma gatingu jednotlivých živých buněk:
















Výsledky:

Populace

        Tato populace představuje

                                 Velikost populace (%)

P1



P2



P3




Otázky a úkoly:
  * Popište, co představuje parametr Forward scatter (FSC)?

Relativní velikost částic/buněk.






  * Popište, co představuje parametr Side scatter (SSC)?

     Granularitu, tzn. vnitřní a vnější strukturu částic.






  * Jaká látka se nejčastěji používá ke stanovení viability buněk v oblasti průtokové cytometrie,
na jakém principu je založena detekce mrtvé populace buněk?

Propidium jodid, prostupuje porušenou membránou a váže se na DNA.