Protokol pro izolaci celkové RNA z kultivovaných buěk pomocí kitu NucleoSpin® RNA II


Obsah kitu:



Před prvním použitím:


ü rDNáza: rozpustit enzym ve stanoveném objemu vody a opatrně zamíchat. rDNáza je vysoce citlivá
k mechanické denaturaci – nemíchat pipetou! Připravené alikvoty jsou uloženy při teplotě –18°C.
OPakovaně nerozmražovat.


ü pufr RA3: přidat 96 – 100% ethanolu ke koncentrovanému pufru RA3.


ü pufr RA1: přidat merkaptoethanol (1:100)




                                           Izolace RNA:


1)   Adherentně rostoucí buňky (maximálně 5 x 10^6) jsou lyzovány přímo na misce přidáním pufru RA1
(350 μl pufru RA1 s 3.5 μl merkaptoethanolu).

2)   Pro snížení viskozity a pročištění buněčného lyzátu jsou lyzáty čištěny pomocí fialových
NucleoSpin® Filter Columns, umístěných do epp. zkumavek (1,5 ml) . Naneste buněčný lyzát a
centrifugujte 1 min při 11000 x g.

3)   Přidejte k homogenizovanému lyzátu 350 μl ethanolu (70%) a důkladně promíchejte opakovaným
pipetováním (5 X). Případné precipitáty by měly být odstraněny.

4)   Naneste směs na modré NucleoSpin® RNA II kolonky umístěné ve sběracích zkumavkách.

5)   Centrifugujte 30 s při 11000 x g. Vyprázdněte sběrnou zkumavku.

6)   Pro odstranění solí naneste na kolonu 350 μl MDB (Membrane Desalting Buffer) a centrifugujte
při 11,000 x g po 1 min aby byla membrána vysušena. Tento krok zvýší následnou účinnost rDNázy.

7)   Připravte reakční směs DNázy – pro každou kolonu smíchejte 10 μl rDNázy a 90 μl reakčního
pufru pro DNázu a protřepte.

8)   Pro odstranění kontaminující DNA naneste na kolonu 95 μl reakční směsi DNázy a nechte působit
15 min při pokojové teplotě.

9)   Pro promytí membrány a inaktivaci DNázy přidejte 200 μl pufru RA2 a centrifugujte 30 s při
11000 x g. Vezměte novou sběrnou zkumavku.

10)              Pro promytí membrány přidejte 600 μl pufru RA3 a centrifugujte 30 s při 11000 x g.

11)              Pro promytí a vysušení membrány přidejte 250 μl pufru RA3 a centrifugujte 2 min
při 11000 x g.

12)              Vložte kolonu do čisté epp. zkumavky bez nukleáz (1,5 ml) a přidejte pro eluci RNA
60 μl vody be RNáz (supplied) a centrifugujte 1 min při 11000 x g. Pro vyšší koncentrace RNA lze
použít objem 40 μl.


Izolovaná RNA je dále skladována při teplotě – 80°C. Koncentrace a přibližná čistota jsou stanoveny
na spektrofotometru Nanodrop.