Fyziologie buněčných
systémů
A. Kozubík J. Hofmanová
Úvodní informace
(východiska a modely)
ÚEB (oddělení/ specializace)
1) Fyziologie a imunologie živočichů
Představení kolektivu
Současné zaměření
Metody a přístupy
Východiska
2) Pracoviště AVČR
ŘEŠENÍ a další postup
Diverzifikace na dvou úrovních:
1) Mezioborová (2 systémy),
2) Odborného směřování (2-3 problematiky)
Náročné, ale možné
Diverzifikovaný systém – pro většinu stabilnější,
méně závislý na jakémkoli neočekávaném vývoji
BFÚ PřF MU
Kasárna, Terezy Novákové 64, Brno - Řečkovice
Pracoviště PřF MU
ÚEB, BRNO
Oddělení
Fyziologie
a imunologie živočichů
II
Nový Univerzitní kampus
Biomedicínkský komplex - FN
Nová podpůrná zařízení
Důsledky převahy
pozitivní zpětné vazby
UK, SK
Nová univerzitní knihovna
11
„Moudrost člověka lze měřit podle starostlivosti, s níž myslí na
věci budoucí nebo na konec.“
G. Ch. Lichtenberg
množství
informace
využitelnost
informace
(kvantita)
(kvalita)
čas
RIZIKADEZINFORMACE
Nestabilní systémy (svět prohlubujících se nerovnováh)
Složení
a
zaměření oddělení
13
Fyziologie buňky (buněčné signalizace)
prof. A. Kozubík
prof. J. Hofmanová
Doc. V. Bryja
Dr. P. Krejčí
Dr. J. Procházková
Dr. K. Souček
Dr. J. Pacherník
(Doc. S. Kozubek, Doc. J. Vondráček, Dr. M. Machala, Dr. Vaculová atd.)
Imunologie obratlovců a bezobratlých
Doc. A. Lojek
Doc. A. Žákovská
Dr. P. Hyršl
(Dr. L. Kubala, Dr. M. Číž, Dr. J. Turánek, atd…)
Fyziologie smyslového vnímání
Doc. M. Vácha
Poznání mechanismů působení látek lipidové povahy,
zejména VNMK a jejich derivátů
v mezi/vnitrobuněčných komunikacích podílejících se
v regulaci cytokinetiky (proliferace, diferenciace a apoptózy v čase)
v kontextu jejich interakcí s
- fyziologickými regulátory růstu,
- environmentálními polutanty
- vybranými farmaky
Některé praktické cíle: Kromě obecného poznání využít tyto znalosti
pro přípravu lipidových nutričních preparátů, případně cytostatik.
NĚKTERÉ HLAVNÍ CÍLE VÝZKUMU
Organismus jako komplexní hierarchický
systém
16
organismální,
tkáňová
molekulovábuněčná
Nelze oddělovat (naopak nutno usilovat)
studium na jednotlivých úrovních organizace systému
Obtížně realizovatelné v rámci jedné laboratoře
Výzkumné cíle a oblasti praktického využití
17
POPULACE NORMÁLNÍCH
(NETRANSFORMOVANÝCH)
BUNĚK
ONKOGENEZE
fáze:
INICIAČNÍ
(INITIATION)
PODPŮRNÁ
(PROMOTION)
„cell signalling“
(cytokiny vs. eikosanoidy)
klinická data,
matematické analýzy,
experimentální ověření
ONKOTERAPIE
PROGRESIVNÍ FÁZE
(PROGRESSION)
POPULACE
TRANSFORMOVANÝCH
BUNĚK
Výzkum
(vývoj)
Aplikovaný
(cílený)
Základní
Výroba
Užití
Kvalitní data – základ experimentálních věd
Přehled metod a metodologií
(ucelený systém)
Hlavní METODY používané v laboratoři cytokinetiky
BFÚ AV ČR, Brno
FM - (fluorescenční) konfokální mikroskopie
SM - světelná mikroskopie
WB - western blotting
FM - fluorimetrie (FluoStar)
CM - kolorimetrie (FluoStar nebo Elisa reader)
LM - luminometrie (VUVEL, Lojek)
PAGE - polyakrylamidová elektroforéza
RT-PCR – real time PCR
RG - radiografie
ELFO – agarózová elektroforéza
FACS - Fluorescence-Activated Cell Sorting
(průtoková cytometrie včetně „cell sortingu“)
KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEICA
Metodologie
využívají nejmodernější zařízení
FACS
Verse
FACS ARIA SORP II
Metodologie
využívají nejmodernější zařízení
Výhody
- Možnost analýz a třídění
živých buněk !!! (UV lasery)
a jejich postoupení pro další
-„Multicolour analyses“
- Optimum poměru cena/výkon
(automatizace / versatibilita)
SYLABUS pro studenty
4. ročníku fyziologie živočichů a obecné zoologie, mol. biologie, chemie životního
prostředí a ekotoxikologie, výběrová přednáška pro doktorandy
n - Stručný úvod do teorie systémů
n - Negativní a pozitivní zpětná vazba
n - Základní pojmy, parametry cytokinetiky (proliferace, diferenciace, apoptóza)
n - Typy buněčných populací
n - Kmenové a diferencované kompartmenty.
Totipotentní, pluripotentní, progenitorové, komitované
diferencované buněčné populace
n - Autokrinní, parakrinní a endokrinní regulace
n - Buněčný cyklus a jeho regulace
n - Faktory ovlivňující buněčné dělení, cytokiny, růstové faktory a inhibitory, jejich specifita
a rovnováha jejich působení
n - Struktura plasmatické membrány a její funkce v regulaci buněčné proliferace a diferenciace
n - Vysoce nenasycené mastné kyseliny a eikosanoidy
n - Transdukce signálů a exprese genetické informace
n - Úloha fosfolipidových komponet v transdukci signálů růst modulujících látek
n - Mechanismus účinku hormonů a tkáňových mediátorů ( cytokiny a "chalony").
n - Regulace proliferace, diferenciace, apoptózy
Krvetvorný systém a jeho funkce
n Hemopoéza ( lymfopoéza, myelopoéza, erytropoéza, megakaryocytopoéza )
n Funkce diferencovaných krevních elementů - monocyty, makrofágy - fagocytóza;
n Vztah imunitního systému k dalším fyziologickým funkcím ( zánětu apod.)
Homeostáza, zdraví a nemoc
n Organismus jako hierarchický systém, spolupůsobení nervové, endokrinní a humorální
soustavy
n Příklady systémových reakcí jako jsou stres, zánět apod. a jejich význam z hlediska zdraví a
nemoci
n Škodlivé faktory vnějšího prostředí a jejich vliv na zdraví lidské populace
Doporučená literatura, zdroje I.
Nezbytné je absolvovat výklad – vlastní poznámky
+ jakákoli MODERNÍ učebnice
- Biochemie
- Molekulární biologie
- Buněčné biologie
Starší literatura:
Cell Physiology Source Book, ed. N. Sperelakis Academic Press Inc., 1995
B. Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, Garland Publish. Inc., New York 1994
Biochemie, B., Voet, J.G. Voetová: Victoria Publishing, Praha, 1990
Molecular Cell biology, J.E. Darnell: Eds. Darnell, Lodish, Baltimore, 2nd edition,
Scientific American Books Inc., New York 1990
Základy buněčné biologie – úvod do molekulární biologie buňky, B. Alberts, D. Bray, A, Johnson,
J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Espero Publishing, (orig. 1998)
Klinická imunologie, J. Krejsek, O. Kopecký, Nucleus HK, 2004
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
J. Neuwirt, E. Nečas: Kmenové buňky a krevní choroby, Avicenum Praha 1981
J. Vácha: Problém normálnosti v biologii a lékařství, Avicenum, Praha 1980
J. Šterzl: Imunitní systém a jeho fyziologické funkce, Čs. Imunol. Společnost, Praha 1993
Apoptosis - Physiology and Pathology (ISBN: 9780521886567 Rok vydání: 2011)
Editor: John C. Reed
Author: Douglas R. Green
Vydavatelství: Cambridge UP
http://www.cambridge.org/us/academic/subjects/life-sciences/cell-biology-and-developmental-biology/apoptosis-physiology-and-pathology
Means to an End: Apoptosis and Other Cell Death Mechanisms (ISBN 978-0-879698-88-1 Rok vydání: 2011)
By Douglas R. Green, St. Jude Children’s Research Hospital
http://www.cshlpress.com/default.tpl?cart=14030831131413924&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=884
The Molecular Basis of Cancer (ISBN: 978-1-4557-4066-6, Rok vydání: March 2014)
Autor: John Mendelsohn, Peter Howley, Mark Israel, Joe Gray
Imprint: Saunders
http://www.elsevier.com/books/the-molecular-basis-of-cancer/mendelsohn/978-1-4557-4066-6
The Biology of Cancer (ISBN: 9780815342205, Rok vydání: 2013)
Autor: Weinberg R.
Vydavatelství: Garland Science
http://www.malecentrum.cz/9780815342205-the-biology-of-cancer/
Molecular Cell Biology, 7th ed. (ISBN: 9781464109812, Rok vydání: 2013)
Autor: Lodish H.
Vydavatelství: W.H. Freeman
http://www.malecentrum.cz/9781464109812-molecular-cell-biology-7th-ed/
Histology: A Text and Atlas: With Correlated Cell and Molecular Biology, 6/e, International Edition (ISBN: 9781451101508Rok vydání: 2010
Author: Michael H. Ross
Vydavatelství: Lippincott Williams
http://www.malecentrum.cz/9781451101508-histology-a-text-and-atlas-with-correlated-cell-and-molecular-biology-6/e-international-edition/
Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition (ISBN 978-1-936113-01-9, Rok vydání: 2014
• 814 pp., illus. (42 4C, 134 B&W), index
http://www.cshlpress.com/default.tpl?cart=14030882921652554&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=982
Recentní literatura II.
POJMY A MODELY
Typy buněčných populací
29
TYPY PROLIFERUJÍCÍ
expandující, neopouštějí
populaci, množí se
stacionární
c. konstantní
Tranzitní populace, ve
které se buňky pomnoží
c. konstantní
populace coby zdroj
buněk pro jiné populace
c. konstantní
NÁDOR
BLASTY
KRVE
K. B.
stále ubývá typ průchozí (tranzitní)
c. konstantní
B.
C.N.S.
OOCYTY
metamyelocyty
k. d.
erytrocyty
granulocyty
TYPY NEPROLIFERUJÍCÍ
podle Gilberta a Lajthy (1965)
Tabulka 1
Dělení buněčných populací podle intenzity obnovy u dospělé myši
1. Statické populace bez známek obnovy během života:
neurony všech typů
srdeční svalové buňky
odontoblasty
Sertoliho buňky
2. Velmi pomalu se obnovující buněčné populace:
Během života se obnoví jen část populace:
hladké svalové buňky
gliové buňky
osteocyty
buňky ledvinných tubulů
buňky dřeně nadledvinek
hlavní buňky žaludeční sliznice
intersticiální buňky Leydigovy
buňky hnědé tukové tkáně
3. Rychle se obnovující buněčné populace:
A. Ne příliš rychle se obnovující populace. Populace, která se během života zcela obnoví, ale
za dobu delší než 30 dní:
hepatocyty a litorální buňky
epitelová výstelka dýchacího traktu
buňky slinných žláz
buňky pankreatu
buňky v kůře nadledvinek
parietální buňky žaludeční sliznice
pojivové buňky v kůži
B. Velmi rychle se obnovující buněčné populace. Všechny se obnoví za dobu kratší než 30 dní:
střevní epitel
krvetvorné buňky, prekursory krevních buněk
epidermis
kornea
epitelová výstelka ústní dutiny a esofagu
povrchový epitel žaludeční sliznice
seminiferní epitelová tkáň
C. Buňky nádorové
BIOLOGICKÉ MODELY:
Buňky tzv. intenzívně proliferujících populací
(zejména buňky krvetvorné),
anebo
buňky nádorové
(leukemické, střevních epitelů, prostaty, etc.)
Jestliže dojde k celotělové expozici
organismu ionizujícím zářením,
může dojít k rozvoji tzv.
nemoci ozáření – manifestaci tzv.
RADIAČNÍHO SYNDROMU.
Jeho průběh závisí na dávce ozáření
Jestliže dojde k celotělovému vystavení ionizujícímu záření, dochází k rozvoji tzv. RADIAČNÍHO SYNDROMU
provázeného devastujícími účinky na organismus
(Nevada, USA)Dobový kontext
od 40.- 80. léta 20. stol.
Radiobilogický výzkum
především pro vojenské účely.
Důsledky:
Utlumení a poškození krvetvorby
(intenzívně proliferujících populací)
imunitních funkcí a celého organismu.
Vznik nádorů včetně leukémií atd. ,smrt.
dávka hlavní oblasti postižení
Dřeňová forma……………..0.1- 6 Gy…….Kmenové buňky K.D.
Střevní forma ………………5 – 10 Gy…….Epitely, zejména střeva
Centrálně nervová forma….100 Gy………Viz výše včetně C.N.S.
Důsledky:
silné poškození intenzívně proliferujících populací, organismu,
imunitních funkcí a celého systému:
proliferativní choroby, leukémie, smrt.
Formy nemoci z ozáření (myš)
Využití ozáření jako modelu
pro studium regenerace
krvetvorných funkcí
Princip,
volba dávky,
volba druhu laboratorního zvířete (myš)
Metoda CFU-S
36
Fosfolipidový metabolismus
a působení ionizujícího záření
(škodlivých faktorů
životního prostředí)
(EIKOSANOIDY) Zánět, karcinogeneze
KOMPLEXNÍ ODPOVĚĎ
37
The early acting growth factor which
maximises host
defense
38
Regulátor
Typy regulací
(růstu a buněčných funkcí)
1) Hormonální (endokrinní) regulace
– hormon je produkován buňkami žláz s vnit řní sekrecí do krevního řečiště.
Ovlivňuje funkce buněk, které mohou být značně vzdálenyod míst syntézy hormonu.
Hormon – je tedy produkován za účelem kontroly činnosti buněk než těch, které jej produkují
2) Parakrinní regulace
Mechanismus působení spočívá v tom, že růstový faktor (regulátor) – tkáňový mediátor
(regulátor místního p ůsobení) je syntetizován jedním typem b.
.
poté je transportován do
extracelulárního prostoru aovlivňuje f-ce buněk v nejbližším okolí.
(často jediná možnost vzhledem k velmi krátkému poločasu rozpadu)
3) Autokrinní regulace
je možná tehdy, jestliže jsou buňky schopny jak syntetizovat tak i reagovat na určitý (růstový)
regulátor.
Pozn.: autokrinní model je součástí konceptu vysvětlujícího abnormální regulaci nádorového
růstu.
Předpokládá, že nádorově změněné buňky produkují stimulační růstové faktory nadměrném
množství, na které samy odpovídají. Tak se autostimulují ve smyslu aktivace proliferace.
Proliferace:
je ekvivalentem buněčného dělení
( tzn. zvýšení počtu kvalitativně totožných buněk)
Diferenciace:
„rozrůzňování buněk“ (vznik kvalitativně odlišných buněk)
Růst
zvětšení „objemu“ buňky, buněčné populace (tkáně nebo organismu).
Je důsledkem:
a) zvětšení velikosti buněk při zachování konstantní velikosti populace
b) zvětšení počtu buněk (proliferace) bez změn v objemu buněk
c) zvýšení počtu buněk i jejich objemu
Apoptóza: programovaná buněčná smrt, nevede k zánětu
d) odumírání apoptózou nebo nekrózou
Nekróza:
neprogramovaná buněčná smrt, je příčinou zánětu
(odlišný průběh biochemických reakcí, rozdílná morfologie)
Seznam používaných zkratek
kmenových buněk:
BFU-E - burst forming unit - erythroid (jednotka vytvá řející explozivně vznikající kolonie erytroidní řady).
Velmi nezralá kmenová bu ňka erytroidní řady.
CFU-BL - colony forming cell - B - lymfocyte (buňka vytvářející kolonie lymfocytů B).
CFU-C - colony forming unit - culture (jednotky vytvá řející kolonie v kultuře).
(GM-CFC) Kmenová bu ňka bílé řady, v poslední dob ě stále častěji používaná zkratka
GM-CFC – granulocyty macrophage-colony forming cell (buňka vutvářející
kolonie pro granulocyty a makrofágy).
CFU-E - colony forming unit - erythroid (jednotka vutvá řející kolonie erytroidní řady.) .
Kmenová bu ňka erytroidní řady
CFU-Meg- colony forming unit - megakaryocyte (jednotka vytvá řející kolonie megakaryocytů).
Kmenová bu ňka erytroidní řady.
CFU-S - colony forming unit - spleen (jednotka vytvá řející kolonie ve lsezině).
(CFU -
GEMM)
Nejběžnější používaná zkratka pro hemopoetickou pluripotentní kmenovou buňku.
DCPC – diffusion chamber progenitor cell (kemnová progenitorová buňka proliferující v difúzních
komůrkách.)
42
Polyklonální charakter kostních buněk
Přirovnání kmenové buňky ke stromu
The early acting growth factor which
maximises host
defense
43
44
Struktura hemopoetického systému
Obr. 8. Schéma kvantitativního zastoupení různých prekurzorů krevních buněk v krvetvorné tkáni.
1 Podle Gregorové a Henkelmana (1977)
2 Podle MacVittieho a Provaznika (1978)
3 Nejsou odvozeny od CFU-S
45
46
48
Dosažení dynamické rovnováhy
49
50
treatment: ovlivňovaný systém parametry cytokinetiky:
VSTUPY
modelové systémy in vitro, buňky lišící se
růstovou „strategií“, pacient VÝSTUPY
„black box“
cytostatika,
ozařování, …
regulační
podněty, atd.
... „0“
proliferace
diferenciace
apoptóza
Jednoduché, snadno měřitelné
integrální ukazatele
některá
OBECNÁ VÝCHODISKA,
DŮLEŽITÁ PRO POSTIŽENÍ CHOVÁNÍ A SMĚROVÁNÍ BUNĚČNÝCH
POPULACÍ, Z NICHŽ LZE VYCHÁZET, MOHOU BÝT TATO:
- Zachování rovnováhy v nejširším slova smyslu mezi produkcí buněk (intenzitou
proliferace) a jejich úbytkem (např. smrtí apoptózou) je podmínkou pro zachování
homeostázy na tkáňové úrovni.
- Proto změny v intenzitě proliferace, diferenciace a apoptózy po působení jakýchkoli
podnětů, jež mohou tyto procesy ovlivnit, lze chápat jako integrální ukazatele
porušení této homeostázy.
- Vhodný způsob detekce těch změn, které vedou k trvalejšímu porušení rovnováhy
mezi produkcí a úbytkem buněk může celkově odrážet nejen poruchy, které jsou
základem tzv. proliferativních chorob (nádorových onemocnění), ale být i ukazatelem
procesů vedoucích k obnově porušené rovnováhy.
- Parametry, jimiž lze postihnout tyto tendence, by proto měly být předmětem zájmu
nejen teoreticky orientovaných pracovníků, ale i laboratoří zabývajících se účinky
škodlivých látek vnějšího prostředí, šlechtitelských a zejména klinicky
orientovaných laboratoří.
52
Rovnováha (homeostáza)
53
Výsledek působení mnohočetných zpětných vazeb
54
Příklad interakce dvou faktorů (data: Eur. J. Pharmacol. 316, 349–357, 1996.)
55
REGULACE „NORMÁLNÍHO“ RŮSTU
1A Schematické znázornění stimulace a inhibice růstu specifickými a nespecifickými faktory. Převaha pozitivního nebo
negativního signálu rozhoduje o výsledné stimulaci nebo inhibiciů závisí na metaboluické a růstové aktivitě buněk, typu buněk
a dalších podmínkách - viz text. Specifické růstové účinky vnějšího prostředí buněk zahajují specifické růstové faktory
(specifické stimulátory) a specifické endogenní inhibitory (chalony). CSF-kolonie stimulující faktor, EGF-epidermální růstový
faktor, FGF-fibroblastový růstový faktor, NGF-nervový růstový faktor, MSA-multiplikaci sti-mulující aktivita,
cAMP-cyklický 3´5 -guanosinmonofosfát, BSC-1, BHK-1, MCIF, FGRF-specifické inhibitory daných buněčných linií.
STIMULACE
INHIBICE
Startovací inhibitorová síla
(odpověď vše nebo nic)
R
Ů
S
T
Mono-
Oligo-
Poly-
Nesspecifické
faktory
kumulace katabolitů
vyčerpání živin
transmem.pot. Em -70 až -90 mV
limitní konc. Na+/K+, Ca2+, Mg2+
snížení cGMP~10-8-10-12 mol.l-1
intracel.
zvýšení cAMP 10-2-10-5 mol.l-1 extr.
katabolické steroidy
interferon
katecholaminy, adrenalin
některé mitostat. hormony ACTH
některé prostaglandiny
inh. myeloidní leukémie
inh. epid. karcinomu, ascitu
inh. lymfomu, melanomu
epidermální, intestinální inh.
FGRF, MCIF inh. Atd.
BSC-1, BHK-1 inh
spec. inhibitory-chalony
spec. endogenní inhibitory
spec. intracel. stim. proteiny
spec. růstové faktory
růstové proteiny, kondic.média
poietiny, CSF
lektiny (A, conc. A)
somatomediny
některé prostaglandiny
EGF, FGF, NGF, MSA atd.
některé hormony - mitogenní
inzulín, serotonín
hydrokortizon, noradrenalin
anabolické steroidy
zvýšení cGMP 10-3-10-6mol.l-1 extr.
snížení cAMP pod 10-8 mol.l-1 i.c.
dodání Ca2+ nad 1,8 mV
transmem. pot. Em -10 až -70 mV
proteázy, trypsinizace
dodání živin
odstránění katabolitů
Mono-
Oligo-
Poly-
Nesspecifické
faktory
Startovací stimulátorová síla
(odpověď vše nebo nic)
Regulace a inhibice
růstu normálních a
nádorových buněk,
Fremuth F., SPN,
Praha, 1986
mRNA
RE
proteiny
inhibice
(NSAID)
membránové
fosfolipidy
jaderné receptory
transkripční faktory
(NFkB, PPAR, AP-1...)
signální
kaskáda
membránová
fluidita
PUFA
vnitrobuněčné
funkce
membránové
fosfolipidy
SIGNÁL
(např. cytokiny)
sekrece
inserce
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-3 PUFA
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony,
polutanty, záření)
eikosanoidy
LOX COXP450
kyselinakyselina arachidonováarachidonová
ROS
lipidová
peroxidace
genová exprese
DNA
mRNA
RE
mRNA
RE
proteiny
inhibice
(NSAID)
membránové
fosfolipidy
jaderné receptory
transkripční faktory
(NFkB, PPAR, AP-1...)
signální
kaskáda
membránová
fluidita
PUFA
vnitrobuněčné
funkce
membránové
fosfolipidy
SIGNÁL
(např. cytokiny)
sekrece
inserce
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-6 PUFA
(AA, LA)
n-3 PUFAn-3 PUFA
Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony,
polutanty, záření)
eikosanoidy
LOX COXP450
kyselinakyselina arachidonováarachidonovákyselinakyselina arachidonováarachidonová
ROSROS
lipidová
peroxidace
lipidová
peroxidace
genová exprese
DNA
(stresory)
změny metabolismu,
buněčného růstu
diferenciace a apoptózy
lipidové
rafty
MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY působení ω-3 a ω-6 VNMK
(mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě)
Vyváženost tendencí
vs.
tendence k nestabilitě
58
59
Čtyři nejdůležitější skupiny malých
organických molekul v buňkách
Nabídka studia bcl., dipl. i DSP na našem oddělení
(na pracovištích PřF i AVČR v Brně)