Deregulace cytokinetiky (možnosti ovlivnění II) (homeostáza, zdraví a regenerace organismu) A. Kozubík Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů) Brno Deregulace cytokinetiky: Další příklady jejího ovlivnění Biologické „cíle" cisplatiny (adukty s DNA) Novel Concepts in the Development of Platinum Antitumor Drugs Curr. Med. Client. - Anti-Cancer Agents, 2002, Vol. 2, No. 4 3 Typy DNA laduktů •t Intra- 1,2 GpG IntraíIrand (80-90%) "A NH -G \c — -C-G— H3\ yNH3 -G—X—Q- ■c—x—c- 1,2 A pG in tra stran d 1.3 GpXpG intrastrand 3 fľGkVGľlCG im&) ! jejich výskytu NH3 H3N—Fj t— L -G-X- -C-Y" L =crpH2o.s^R In tor- 1.2 GpG ínterstrand monofu fictional G-addutt mono- Fig. (2). Types of cisplatin-DNA adduets and their frequency of formation. Adamantylaminové Pt(ll) a Pt(IV) komplexy Dvojmocné Pt(ll) (reaktivní s DNA) LA-9 Výhoda: Mpofiiní čtyřmocné Pt(IV) w (s DNA nereaktivní) LA-12 Cisplatina (II) JM-216 (1. z řady v klinickém zkoušení) Syntetizované F. Žákem a spol., PLIVA - Lachema Zak etal., 2004, J Med Chem, [ci]ex=ioomM I plasma I Cisplatin (II) plasma (lipofóbní) NUCLEUS NH3 cisplatin LA-12 (IV) I reaktivita t lipofilicita (capacity factor HPLC) UUUUUUUUUUUUU! ^ Zvýšený influx LA-12 (FAAS) (19-5x u A2780; 29.3* u A2780cis) ^ Snížená reaktita s cílovými biomol. "\ speciální typy velkých nereparabilních excisiní reparací LA-12 TTŤ Replication inhibition Transcription inhibition I Cell-cycle arrešT DNA repair Cell death Úloha vybraných proteinů - Cyklin A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu); - p21, Gadd45oc („p53 target genes" - regulace b. cyklu); - Bax (apoptóza); - Gadd 45a („DNA repair"); - Mdm2 (regulace stability p53) Cdk1 cyclin B I + El What tp53 the p53 protein is made, itjums og the gene for a JT kilodaltorEfrrotein that dIocks udlTenzymes, and thus cell division. DNA synthesis ▼ Cell division Science 262, 1644, 1993 Cytotoxic action and molecular basis of cisplatin ZH Siddik Molekulární podstata cytotoxického působení cisplatiny iniciované adukty DNA B. smrt závisí na relativní intenzitě Signálů LA-12? NH,N ^Cl NH, Cl Cisplatin Figur* ci splat in-induced cellular effects. Cell death or cell survival will depend on the relative intensity oT the signals generated and the crosstalk hetween the pathways involved. Some of the signaling discussed in the text has been omitted for clarity Oncogene {200 3} 22, 7265-7279 U buněk rezistentních k cisplatině je f-ce p53 (dráhy vedoucí k apoptóze) narušena. Přispívají k tomu změny v regulaci proteinů r. Bel, Fas, Survivinu, Glutathionu Mutant p53 p53 regulation _L |XIAP jYIdinj) \ (PI3K [Bcl-xL] ^urvi^) —I Caspases GSH Akt 1 Bad Figuře 6 Disruption of p53-dependecil apoplolic pathway in ci spi aL in -re si si a n t tumor cells Oncogene „Dose-response" křivky (Mutest) Nejcitlivější k cis-DDP z panelu senzitivních ovariálních buněk (H134, IGROV-1, OVCAR-3),s najnižším % apoptózy (6-14%) (Kolfschoten, G.M. et al., Gyn. Oncol., 2002) Získaná rezistence udržovaná přídavkem cisplatiny do kultivačního média (výsl. konc. 1 uM, každá 2. pasáž) A2780 Cisplatin: ICS0 = 1.34fiM ICgo = 6.17íiM ICeo = 0.22 0 ICgo = 1.00 fiM 0.01 0.1 10 100 1000 A2780CÍS 120 n Cisplatin: IC50 - 24.23 0 IC90 = 48.07 0 IC50= 1.40-|lM 0.01 0.1 10 100 1000 Concentration [^íM] Faktor rezistence (18:6) = 3 Concentration [^iM] Fig. 2. Time- and dosc-rcspouse effects on the survival of A2780 and A2780cis cancer cell lines. The effects after 72 h exposure to cisplatin or LA-12 in a concentration range between 0.3 (iM and 256 (iM were determined by MTT assay. The calculated drug concentrations inhibiting metabolic activity of cells by 50% (IC50) and 90% (1C90) are displayed for both derivatives. The results are expressed as mean ± standard deviations (S.D.) of at least three independent experiments; all concentrations were tested in three replicates. Kozubik etal., 2005, Biochem Pharmacol Kozubik etal., 2005, Biochem Pharmacol Rozdílný vliv cis-DDP a L A-12 na buněčný cyklus A2780cis\ 24 hr G0/G1: 51.1 =4.4% G0/G1: 18 4 ± 10.0 % (*) G0/G1: 24.3 ± 6.3 % (*) 4B hr Kozubik etal., 2005, Biochem Pharmacol Účinky LA-12 a cisplatiny na b. cyklus jsou u ovariárních nádorových linií rozdílné. Detekovány hladiny proteinů: - Cyklin A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu); - p215 Gadd45cc („p53 target genes" - regulace b. cyklu); - Bax (apoptóza); - Gadd 45a („DNA repair"); - Mdm2 (regulace stability p53) Cdkl-cyclin B Cdkl-cyclin A Hladiny proteinů regulujících buněčný cyklus (cyklin A, B1, cdk2) u buněk A2780 a A2780cis po působení LA-12 a cisplatiny 6 h 12 h 24 A2780 V" ^ A^ ^ A2780cis ^ ^ \F A27S0 cyclin A Foldincrea&e O/ iľy Lv Tľ ľ3 1.0 1.1 10 11.0 1.1 1.2 A2780cis A2780 cdk2 Fold iiicrease 1.0 1.0 1.0 cyclin B1 A2780cis 1.0 1.1 1.1 1.0 1.0 O.S Fold increase 1 u :).> 0.S p-actin 1.0 0.9 0.9 1.0 1.1 1.1 1.0 1.2 1.1 1.0 1.1 1.2 1.0 1.2 1.1 10 13 11 10 10 1.0 1.0 1.2 0.8 — WS — 1 1.0 13 13 10 1.4 1.2 Nebyly pozorovány žádné změny a A2780cis Equitoxické koncentrace cis-DDP indukují vyšší expresi proteinu p53 (teoreticky vyšší poškození DNA, než po apl. LA-12 a tudíž by cis-DDP měla působit efektivněji), Nebylo tomu tak, tzn. že by musí existovat jiné. např. s poškozením DNA nesouvisející mechanismy působení LA-12 !!!!!! PARP-substrát kaspázy A2780 A2780cis jí (a) PARP 24 li p53 113kDa 89kDa 113 kDa 89 kDa 113 kDa 89 kDa 53 kDa 53 kDa 53 kDa 1 i o 3° o r 3 > 3 8 B 8 13 ' 5' r-£ í r 24h 3.1± o.K* 4.» 1.4* 0.1 2.3± 0,8' 24h 1 &.2± 1.1* 8.2 i l.ď 2.5i 0.2" 2.8± 0.9" 4Sli 1 4. [± 1.4 6.S± 1.8* 2.6± 0.2 Í.Si 1,9* 4Sh 1 <ř.S± 1.9* 6.9 ± 0,2* í.2t 0,5= }.4± 72b 1 1.5± 0 6* 3.7± 07* 1.6± 0.2 í.5± 0.6* 72h 1 5.6± 2.0« 7.0* 28« 3.3± 11.8 3.3± 1.0 (d) p-actin 42 kDa Fig. 8. Western blot analyses of (a) PARP (upper panel) and (b) p53 (middle panel) protein levels in A2780 (left panel) and A2780cis eells (right panel). The cells were not exposed (untreated controls) or exposed to (Cjo or [C90 concentrations of cisplatin or LA- !2 and harvested at 24 h.4M h, and 72 h of sustained drug treatment. One representative experiment of at least three is presented. Table (c) contains values of p53 expression quantified by densitometry (mean ± S.D. of at least three independent experiments). The symbols (*) denote significant difference (/j < 0.05) from untreated control; (#) denote significant difference (p < 0.05) between equitoxic cisplatin and LA-12 effects. Equal loading is documented by detection of (d) p-actin (bottom panel). 6h A2780 A2780cis 12h A27S0 A2780cis nn / # .y £ f j- W p53 |------ p21 Gadd45a Fold increase Mdm2 1.0 0.9 1.0 1.0 0.9 1.0 tax FoldlMFase 1.0 1.1 1.0 1.0 1.0 1.2 FoGTifflgfre 1.0 3.1 19 1.0 2.0 0.8 1.0 2.1 1.9 1.0 1.6 1.2 1.0 2.2 2.1 1.0 1.6 0.9 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.1 1.0 1.2 0.8 24 h A2780 A2780cis n 1.0 1.5 1.2 1.» 3.2 3.0 1.0 3.5 2.9 1.0 4.6 0.S - 1.0X5 1.0 i.: i.: 1.0 1.0 0.9 1.0 0.9 0.8 1.0 1.0 0.9 1.0 0.9 0.8 [•JKI p-act in Tyto naše výsledky, i když plně nevysvětlují působení cisplatiny a LA-12, se zařazují mezi ty přístupy které výzkum platinových cytostatik posouvají do nových oblastí. Studie z poslední doby ukazují, že cisplatina inhibuje růst nádorových buněk v koncentracích, které jsou významně nižší, než konc. potřebné pro inhibici syntézy DNA. To naznačuje, že mohou existovat i jiné mechanismy působení než ty, které jsou primárně založeny na poškození DNA Platinová cytostatika mohou reagovat s dalšími buněčnými strukturami (komponenty) jako jsou: RNA, proteiny, cytoskeletální filamenta, thioly- obsahující molekul Odvozené mechanismy mohou být významnou součástí signálních kaskád regulujících dělení a smrt buněk Předpoklad Vzhledem ke své lipopfilicitě, lze očekávat, že alespoň některé příznivé efekty působení LA-12 by mohly být (alespoň částečně), spojeny s interakcemi této látky se složkami b. membrán (anebo by mohly být modulovány ovlivněním membránového složení). ^^^^^^^^^^ MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY působení oj-3 a u>6 VNMK (mediatory a modulátory buněčné signalizační sítě) lipidové rafty změny metabolismu, buněčného růstu diferenciace a apoptózy Předpoklad Komplexnější mechanismy působení Lze očekávat, že alespoň některé příznivé efekty působení LA-12 by mohly být spojeny s interakcemi této látky se složkami buněčných membrán • r Výsledky reflektující úvahy o potenciálním zapojení fosfolipidových struktur v mechanismech účinků pt-cytostatik Lze vyslovit předpoklad, že u obou námi studovaných pt - cytostatik, lišících se lipofilicitou dochází k významným rozdílům již v dostupnosti do buňky. Dále, je známo, že k rezistenci buněk k cis-DDP může přispívat i složení a distribuce fosfolipidových komponent v membránách. Významné rozdílnosti v „seskupování" lipidů (tzv. „lipid packing", FCM, merocyanin) jsme prokázali i v našich předběžných pokusech u buněk A2780 a A2870cis. Vznik suspenze vhodných polárních lipidů (např. lecithin) + působením ultrazvuku Naše další předběžné výsledky s využitím kalorimetrie provedené na umělých lipozomálních strukturách naznačily, že: zatímco ani cisDDP ani LA-12 samy o sobě nemění vlastnosti lipozóm přidání AA významně mění charakter termogramu ve smyslu zvýšení membránové fluidity. ve smyslu zvýšení membránové fluidity. Kombinace AA s cis-DDP anebo s LA-12 naznačily tendence k fázové separ (změny nebo objevení se druhého píku). Tyto Díky se do kombinaci AA s cis-DDP vs. AA s LA-12 lišil 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 DPPC + CP 1 1 1 1 1 1 1 1 ti Í DPPC i l|lM ——- i 10 flM L 50 nM r ....... ................. I I I I I I I I I I I DPPC + LA12 I i i i i I i i i i DPPC i i i i I i i i ' I I ' i i i I i i i i ,C" 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 TEMPERATURE (°C) 25 30 35 40 45 TEMPERATURE (°C) Vliv CP na DPPC multilamelární lipozómy Vliv LA 12 na DPPC Rozdíly cisplatina (CP) vs LA-12 (DPPC + 100 pM AA) + CP i i i i I i i i i I i i i i I i i i i I i i i i u < u H < w u -X-fc ľTT ^ I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I (DPPC + 100 nM AA) + LA12 i i i i I i i i i I i i i i I i i . i I i i i 25 30 35 40 45 50 TEMPERATURE (°C) 25 30 35 40 45 50 TEMPERATURE (°C) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 DPPC + AA 1 1 1 1 1 1 1 6 DPPC__^^__^ 100 |iM ^ J00jM_^___^—_A^^ i i i i 1 i i i i 1 i i i i 1 i i i i 1 i i i I I I I I I I I I I I I I I I I I I DPPC+DHA 200 |lM I I I 30 35 40 45 50 TEMPERATURE (°C) Vliv AA Po 50|iM AA pozorujeme snížení píku odpovídajcího předpřechodu a zároveň rozšiřování hlavního fázového přechodu - zvýšení fluidity??? přičemž se entalpie přechodu nemění. 30 35 40 45 TEMPERATURE (°C) Vliv DHA je zřejmé, že tendence změny je podobná jako po AA. (DPPC + 100 (iM DHA) + LA 12 10 ^iM LA12 'i 'i I 'i 'i I 'i 'i I 30 35 40 45 TEMPERATURE (°C) Je dále známo že k rezistenci buněk k cis-DDP může přispívat složení a distril fosfolipidových komponent v membránách. Významné rozdílnosti v „seskupování" lipidů tzv.Jipid packing", FCM, merocyanin - váže se na, lipidů (zvýšení flurescence) - cca odráží míru fluidity jsme prokázali i v předběžných pokusech rozvolněnou" strukturu u nádorových buněk ovarií A2780 a (se získanou rezistencí). Dynamický charakter biologických membrán (model) Pietzsch J et al., Nature Reviews, October 2004 Glycosylphosphatldylinositol (GPI) Zajištění většiny biologických funkcí se neobejde bez unikátních interakcí lipidových komponent1) s dalšími biologicky významnými molekulami. Jejich modulace mohou významně měnit intenzitu a také směr sign. transdukce LA-12 indukuje „upregulaci" DR5 mRNA, celkových povrchových proteinů, a zvyšuje zastoupení DR5 v lipidových raftech Zastoupení DR5 a DR4 v membránách - HCT116 - Celkové hladiny DR5 (rafty) § 5 c o 3 '» v. e 2 a. H Cl Q 0 I-1 DR5 T I Cisplatin (;:M) LA-12 (/iM) Celkové hladiny DR5 0.1 0.5 1 1.5 DR5 p-actin 1.5 o " 1 o •a o 0.5 cisplatin LA-12 Lokalizace DR5 v lipidových raftech Využití mechanismů působení pt-cytostatik jiných než těch, které přímo souvisí s poškozením DNA EXPERIMENTÁLNI IVNĚNÍ cytostatika nové generace (LA-12) „přenos signálu" membrána-cytosol-jádro UCINEK zmeny fluidity membrán ovlivnění metabolismu PUFAs poškození cytoskeletu, oxidatívni stres... apoptóza buněčný cyklus a proliferace Podstata možných návrhů projektů - prozatím neuzavřeno