SYSTÉMY ZPROSTŘEDKOVANÉHO PŘENOSU DNA A. Transdukce E. coli, S. typhimurium, Bacillus, Klebsiella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces Nespecifická (P22, P1, SPβ, φ11) abortivní Specifická (fág lambda) B. Kapsdukce Rhodobacter capsulatus (GTA = gene transfer agent) (VTA = Methanococcus voltae) Jsou přenášeny libovolné geny Jsou přenášeny jen určité geny přenos bakteriální DNA (chromozomové nebo plazmidové) bakteriofágem Objev transdukce – 1952 (Zinder a Lederberg) Salmonella typhimurium, fág P22 Studium auxotrofních mutant – vznik prototrofních rekombinant - Proces není ovlivněn DNázou - Není nutný kontakt buněk (U-trubice) - Přenosovým agens jsou fágy DONOR - RECIPIENT Transdukující částice = pseudovirion Transduktanta Rekombinantní – přenos chromozomové DNA Abortivní – přenos chromozomové DNA Plazmidová – přenos plazmidů Kotransdukce = současný přenos dvou nebo více genů donora do recipienta transdukcí Proces je závislý na RecA Rekombinantní transduktanta – normální kolonie Abortivní transduktanta – mikrokolonie Odlišení rekombinantních a abortivních transduktant normální kolonie mikrokolonie CHARAKTERISTIKA NESPECIFICKY TRANSDUKUJÍCÍCH FÁGŮ od zlomů na DNA Experimentální důkaz přítomnosti toliko bakteriální DNA v transdukujících částicích fága P22 (při nespecifické transdukci) Chromozom naznačen 15N Dávají vznik transduktantům Lyzují buňky Obecná transdukce – vznik transdukujících částic Fág P22HT = mutantní fág se sníženou nukleázovou specifitou rozpoznávající další „pseudopac“ místa „Pseudopac“ místo P22HT transdukuje plazmid pBR322, který není P22 přenášen POMNOŽENÍ FÁGA NEBO JEHO INDUKCE V DONOROVÉM KMENI uv transduktanta Transdukční směs Pomnožení fága na donorovém kmeni donor B+ fág pomonožení fága transdukční recipient B- směs DNA ve fágu DNA v recipientu K zabránění superinfekce buněk normálními fágy se k transdukční směsi přidávají chelatační agens Minimální medium Transdukce jednotlivých genů Kotransdukce dvou genů Frekvence kotransdukce = 0-100%, v závislosti na vzdálenosti markerů (referenčního a sledovaného) Výhoda: délka transdukovaných fragmentů je ve srovnání s transformací přesněji definována (nízké hodnoty MOI) Transdukující DNA obsahuje buď gal nebo bio anebo gal/bio transdukce leu + +závislost na RecA systému ++ + + + STANOVENÍ FREKVENCE TRANSDUKCE A = y/p y = počet transduktant pro daný znak v 1 ml transdukční směsi p = počet virionů (PFU/ml) Parametry ovlivňující frekvenci transdukce velikost genomu fága počet virionů uvolněných z jedné buňky (fágový výnos) aktivita RM systémů v recipientní buňce účinnost procesu rekombinace v recipientní buňce velikost plazmidu VÝPOČET VZDÁLENOSTI GENŮ Z FREKVENCE KONTRASDUKCE C = (1 – d/L)3 C = frekvence kontrasdukce d = vzdálenost markerů (min) L = velikost transdukovaného fragmentu (min) reciproké stanovená třífaktorovým křížením Mapování genů bakterií pomocí transdukce: stanovení pořadí těsně vázaných genů tříbodovým křížením s využitím parciálních diploidů Transdukovaný fragment donora Chromozom recipienta TRANSDUKCE PLAZMIDŮ transdukce plazmidů větších než je genom fága: „transduction shortening“ - zachování počátku replikace + deletovaná část plazmidu transdukce plazmidů menších než je genom fága: zabalování části konkatemerů (replikačních intermediátů - multimerů) transdukce vektorů odvozených z plazmidů - interakce s homologními geny na chromozomu donora, v recipientní buňce cirkularizace Transdukovaný fragment Test intergenové komplementace (cis-trans test) realizovaný abortivní transdukcí Stabilní parciální diploid Specifická transdukce Specifická (specializovaná) transdukce je založena na indukci integrovaného profága. Transdukována může být jen specifická a omezená oblast bakteriálního chromozomu, která přiléhá k inzerčnímu místu profága. Modelovým systémem je transdukce zprostředkovaná fágem lambda u E. coli. VZNIK TRANSDUKUJÍCÍCH ČÁSTIC FÁGA λ PŘI SPECIFICKÉ TRANSDUKCI Získání fágového lyzátu indukcí UV-světlem z lyzogenních buněk E. coli Genom defektní fágové částice chybná excize λpgal – nedefektní fágová částice 10% fágového genomu je nahrazeno Možné způsoby vyčlenění profága lambda normální vyčlenění abnormální vyčlenění Rekombinace v recipientních buňkách gal- infikovaných transdukujícím fágem λdgal+ Frekvence vzniku transdukujících částic = 10-6 (na jeden virion lambda) lyzát LFT (low frequency of transduction) λ dgal λ dbio Po deleci att na bakteriálním chromozomu mohou být využita sekundární místa att - pak dochází k transdukci jiných oblastí chromozomu λ GENOM TRANSDUKUJÍCÍ FÁGŮ λdgal a λdbio Nízká multiplicita infekce Vysoká multiplicita infekce Různé rekombinační události při specifické transdukci typ I typ II 2xCO reverze 1xCO v gal 1xCO 1xCO 1xCO v att lytický cyklus začlenění λ (att) začlenění λ dgal+ UV- indukce homologní rekombinací site-specific integrace HFT 1% buněk bude gal- nebo gal+ - defektní Transduktanty typu I - nelyzogenní Transduktanty typu II - lyzogenní 2xCO 1xCO VZNIK LYZÁTŮ TRANSDUKUJÍCÍCH S VYSOKOU FREKVENCÍ (LYZÁT HFT) Dvojnásobně lyzogenní kmen (λ + λ dgal) Indukce UV světlem Excize a zabalení fágových genomů Lyzát HFT (50% částic je transdukujících) Využití transdukce - Analýza specifických oblastí bakteriálního genomu (gal operon) - Mapování genů - Charakterizace transpozonů – heteroduplexní analýza - Analýza fágových genomů při konstrukci vektorů (odvozených z fága lambda) - HGT: Objasnění evoluce bakteriálních genomů - DNA ve fágové částici je chráněna před působením nukleáz - Řada fágů má široké rozmezí hostitelů (P1 – infikuje G- bakterie) - Mohou být přenášeny plazmidy nebo transpozony s širokým rozmezím hostitelů, chromozomové geny jen v případě homologie OBECNÁ STRUKTURA OSTROVŮ PATOGENITY Ostrov patogenity Geny pro virulenci Počet nukleotidů Inzerční sekvenceGen pro integrázu Přímá opakování VÝZNAČNÉ RYSY OSTROVŮ PATOGENITY Nesou jeden nebo několik genů pro virulenci Jsou přítomny jen u patogenních kmenů daného druhu Představují relativně velké úseky genomu (10 – 200 kb) Mají odlišný obsah GC a jiné využívání kodonů Jsou často umístěny poblíž genů pro tRNA (kotvy pro inzerci cizí DNA) Jsou často spojeny s mobilními genetickými elementy. Často jsou ohraničeny DR (16-130 bp) - rozpoznávací místa pro enzymy zajišťující integraci a excizi mobilních elementů (integráza nebo transponáza) Jsou často nestabilní a jsou deletovány s různými frekvencemi. Mají mozaikovitou strukturu – jsou složené z elementů, které se během evoluce v různé době a z různých zdrojů akumulovaly do určitých míst. SaPI1: 15 kb ostrov patogenity u S. aureus, nesoucí gen tst zodpovědný za syndrom toxického šoku (TSST1) - (horečka, exantém, hypotenze, olupování kůže). SaPI1 je mobilizován fágem 80α. Když fág 80α infikuje buňky S. aureus nesoucí SaPI1, vyčleňuje se ostrov z chromozomu a replikuje se pomocí proteinů fágového replikačního aparátu. Geny ostrova způsobí, že fág 80α vytváří menší hlavy, které pak zabalují přednostně DNA ostrovů spíše než vlastní fágovou DNA. Když vytvořený „pseudofág“ infikuje další buňku, je DNA ostrova injikována do buňky, kde se začleňuje do chromozomu pomocí svého vlastního Int proteinu. Přenos (transdukce) ostrovů patogenity u S. aureus LYZOGENNÍ KONVERZE změna vlastností kmene po infekci fágem, který ve svém genomu nese geny zodpovědné za změnu fenotypu hostitele (faktory virulence nebo toxiny). Příklady Fág lambda: E. coli – rezistence k séru, schopnost přežívat v makrofágách Fág φ361 (příbuzný fágu lambda): E. coli – Shiga toxin Fág β : Corynebacterium diphtheriae – difterický toxin (záškrt) Fág CTXφ: Vibrio cholerae – toxin cholery Fágy u S. aureus: fibrinolyzin, enterotoxin Fágy beta-hemolytických streptokoků sk.A: erytrogenní toxiny Fág u Clostridium botulinum: botulotoxin Fág u Clostridium tetani: tetanotoxin Fág u Salmonella: změny somatických antigenů 8 proteinů, průměr hlavy 30 nm, bičík 30-50 nm, Uvolňování GTA v jedné až dvou vlnách Nebyly identifikovány fágy příbuzné s GTA Gene transfer agent Kapsdukce - Rhodococcus capsulatus (Rhodopseudomonas palustris) PARAMETRY PŘENÁŠENÉ DNA velikost přenášené DNA = 1,5-2 kb (až 5 kb) DNA je heterogenní, tj. je bakteriální přenos až 3-4 genů na jednu částici GTA 105 GTA/ml pro daný marker přenos všech chromozomových markerů frekvence rekombinant 10-4/-5/marker/buňku frekvence „kotransferu“ genů F = 1 - (dL)2 (d = vzdálenost markerů, L = délka přenášeného úseku DNA) Přenos je regulován bakteriálními geny, které indukují expresi strukturních genů GTA během specifické růstové fáze buněk Další GTA – Silicibacter pomeroyi aj. mořský bakterioplankton – počet genů kódujících kapsid, bičík, portál, zabalování DNA, = zhruba 15 genů podobných GTA u R.c. VTA – Voltae Transfer Agent částice podobné bakteriofágům u kmene METHANOCOCCUS VOLTAE PS (Archaea) -Velikost částic je 40 nm, délka bičíku 60 nm -Dvě částice na buňku -Nesou fragmenty chromozomové DNA o průměrné velikosti 4,4 kb -Přenášená DNA je necitlivá k DNAáze -Jsou přenášeny náhodně všechny geny -Frekvence přenosu jednotlivých genů 10 až 10-2 -5 BACTERIOPHAGE-LIKE PARTICLES ASSOCIATED WITH THE GENE TRANSFER AGENT OF METHANOCOCCUS VOLTAE PS. The methanogenic archaeobacterium Methanococcus voltae (strain PS) is known to produce a filterable, DNase-resistant agent (called VTA, for voltae transfer agent), which carries very small fragments (4400 bp) of bacterial DNA and is able to transduce bacterial genes between derivatives of the strain. Examination by electron microscopy of two preparations of VTA that were concentrated and partially purified by different methods showed virus-like particles with isometric heads, about 40 nm in diameter, and with 61 nm long tails. Figure 1. GTA Gene Maps: GTA gene maps from representative, fully sequenced strains used in this study. McDaniel LD, Young EC, Ritchie KB, Paul JH (2012) Environmental Factors Influencing Gene Transfer Agent (GTA) Mediated Transduction in the Subtropical Ocean. PLoS ONE 7(8): e43506. doi:10.1371/journal.pone.0043506 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0043506 Úloha GTA v evoluci mořských bakterií -GTA přenášejí geny mezi různými druhy mořských bakterií -Frekvence přenosu genů = 6.7 × 10−3 až 4.7 × 10−1 jsou tisíckrát až milionkrát vyšší než frekvence přenosu transformací nebo transdukcí -Umělý přenos genů AntR v uzavřených nádobách s mořskou vodou – až 47% bakterií získalo tyto geny a integrovalo je do svého genomu ?? – stejný způsob přenosu genů i mezi klinickými kmeny GTA = „promiscuous little bastards“ Roseovarius nubinhibens, Reugeria mobilis