STAFYLOKOKY
praktikum č. 1
Lékařská mikrobiologie – cvičení
Mikrobiologický ústav LF MU
Před tímto cvičení byste měli umět:
 Práce s mikroskopem
 Gramovo barvení
 Zásady práce v mikrobiologické laboratoři
 Vyplněný odpovědník a vytištěný protokol (před
každým cvičením)
Stafylokoky
 G+ koky, nesporulující, nepohyblivé, často ve shlucích
ve tvaru hroznů (lat. staphyle – hrozen).
 Velmi odolné proti vyschnutí, vyšší koncentraci solí
(diagnostický znak).
Dělení stafylokoků
 Rozdělení podle koagulace plazmy na:
 koaguláza pozitivní (S. aureus)
 koaguláza negativní (CoNS – S. epidermidis)
Staphylococcus aureus
(zlatý stafylokok)
 Jediný pro člověka běžně významný z tzv. koaguláza
pozitivních stafylokoků.
 Původce infekcí kůže, chlupů, nehtů, otitis externa,
zánětů spojivek, infekcí DCD (i HCD).
 Někdy také původce abscesů ve tkáních.
 Některé kmeny, vybavené určitými nikoli běžnými
faktory virulence, způsobují závažné, ale vzácné
choroby.
 Na druhou stranu mikroba nalezneme i na kůži zcela
zdravých osob.
Faktorů virulence, nalézaných u S. aureus,
je veliké množství…
http://www.ratsteachmicro.com
…ale jen
některé jsou
přítomny u
téměř 100 %
kmenů; jiné jsou
produkovány
třeba jen
jedním kmenem
z tisíce!
Koaguláza negativní stafylokoky
 Koaguláza negativní stafylokoky (Staphylococcus
epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus a asi čtyřicet dalších
druhů a poddruhů) jsou hlavní součástí běžné bakteriální
mikroflóry kůže.
 Mohou být ale původci močových infekcí (hlavně S.
saprophyticus), případně i infekcí ran, katétrových sepsí aj.
 Jejich nález se tedy hodnotí jinak např. ve výtěru v nosu
či ve stolici, jinak v moči, a zcela jinak v hemokultuře.
Staphylococcus epidermidis
 Staphylococcus epidermidis, nejběžnější z takzvaných
koaguláza negativních stafylokoků.
 Koaguláza negativní stafylokoky patří do stejného
rodu jako zlatý stafylokok.
 Jsou mnohem méně patogenní než S. aureus
 V poslední době jsou však velice významnými původci
infekcí u oslabených osob, zejména nemocničních.
 Na katétrech a jiných plastech často tvoří biofilm.
Klinický význam stafylokoků
 Hnisavé infekce kůže
 Hnisavé infekce ran
 Hnisavé infekce měkkých tkání - abscesy
 Hnisavé infekce tvrdých tkání
 Sepse
 Infekce močových cest – S. saprophyticus
 Intoxikace - stafylokoková enterotoxikóza
- syndrom toxického šoku (TSST-1)
Abscesy
 Na rozdíl od streptokoků, které vytvářejí ve tkání
zpravidla neopouzdřené flegmóny, tvoří
stafylokoky spíše opouzdřené abscesy.Vznik
abscesu (pomocí tzv. clumping faktoru a
plasmakoagulázy – viz dále!) ukazuje následující
schéma, převzaté z německých internetových stránek.
http://www.autovaccine.de/abscess_formation/Abszess_b.jpg
Příklady infekcí způsobených zlatým
stafylokokem: Impetigo…
http://pathmicro.med.sc.edu/fox/staph-impetigo.jpg
…bulózní impetigo…
http://www.adhb.govt.nz/newborn/TeachingResources/Der
matology/BullousImpetigo/BullousImpetigo3.jpg
…otitis externa s
furunklem…
www.merck.com/mmpe/print/sec08/ch088/ch088c.html.
…či infekce kůže s krustami…
http://www.dermatology.co.uk/media/images/Infection_staphylococcus_crusting_chin_closeup.jpg
…ale také např. mozkové abscesy
http://www.mja.com.au/public/issues/176_12_170602/got10354_fm.html
Diagnostika
 Přímé metody jsou mikroskopie, kultivace, biochemické
identifikační metody, průkaz antigenu, průkaz DNA,
pokus na zvířeti apod.
 Přímé metody aplikujeme na vzorek (přímý průkaz ve
vzorku) nebo na kmen (identifikace izolovaného
kmene).
 Nepřímé metody jsou ty, kterými prokazujeme
protilátky.
Diagnostika
1) Kultivace: na KA kolonie větší (2 mm), ploché,
máslovité konzistence, bílé, anebo
(hlavně u zlatého stafylokoka) nazlátlé
2) Mikroskopie: grampozitivní kok
3) Biochemické testy: kataláza pozitivní, oxidáza negativní,
biochemicky lze rozlišit jednotlivé druhy
4) Testy na přítomnost koagulázy – S. aureus nebo CoNS
5) Komerčně dostupné testy – např. STAPHYtest 16
Autor: Prof. MVDr. Boris Skalka, DrSc.
Diferenciální diagnostika 1
 Gramovo barvení – rozliší grampozitivní a
gramnegativní koky / tyčinky.
 Pozitivní kataláza - odliší stafylokoky od streptokoků a
enterokoků. Oxidázu bychom případně využili k odlišení
mikrokoků (v praxi výjimečně).
 Stejnou službu (a ve směsi mikrobů ještě lepší) udělá
kultivace na KA s 10 % NaCl (6,5 % NaCl na kultivaci
enterokoků).
Katalázový test (pro připomenutí) – H2O2
Photo:Veronika Holá
Diferenciální diagnostika 2
 Plasmakoaguláza je pozitivní u zlatého stafylokoka,
negativní u koaguláza negativních. Konvertuje fibrinogen
na fibrin (tvorba abscesů, typické shlukování buněk
stafylokoků).
 Volná – uvolňuje se do prostředí
 Vázaná (clumping factor)
 Komerční testy na bázi antigenní analýzy jsou naopak
velmi spolehlivé.
 Hyaluronidáza – hydrolyzuje kyselinu hyaluronovou, je
nejen spolehlivá, ale i levná.
Méně spolehlivé testy
 Hemolýza: Koaguláza negativní stafylokoky mohou
produkovat jen delta hemolyzin, zlaté i alfa a beta, mívají
proto mnohem výraznější hemolýzu
 Nazlátlé zbarvení kolonií a jejich větší průměr může
také napovědět.
 Větší shluky v mikroskopii
jsou také typické pro zlaté stafylokoky.
Foto: archiv Mikrobiologického ústavu
Přehled diagnostiky (zjednodušeně)
http://www.ratsteachmicro.com/Staphylococci_Notes/HCOE_CAI_Review_Notes_Staphylococci.htm
(nebo další testy)
Diagnostika CoNS
 Ve většině případů se spokojíme s tím, že jde o
koaguláza negativního stafylokoka a netrváme na
druhovém určení.
 Pokud na druhovém určení trváme (např.
u hemokultur), lze je provést biochemicky.
Api Staph – zahraniční obdoba našich
STAPHYtestů 16
http://www.microbes-edu.org
 V našich podmínkách se nejčastěji používá
STAPHYtest 16 (Erba-Lachema). Bez ohledu na
provenienci konkrétního testu zůstává princip stejný –
kombinace většího počtu enzymatických reakcí, které
se projeví změnou zbarvení reakčního důlku.
Jiná varianta testu API-Staph
 Na předchozím obrázku byl API-Staph pro
automatické odečítání ve fotometru, tato varianta je
pro „okometrické“ odečítání.
http://www.microbes-edu.org
Antimikrobiální terapie - diagnostika
http://www.microbes-edu.org
Podle situace
používáme buď
kvalitativní, nebo
kvantitativní testy 
 Diagnostiku uzavírá testování citlivosti na antibiotika,
zpravidla difusním diskovým testem.
 Konkrétní provedení může být různé.
Antimikrobiální terapie
 U stafylokoků je lékem volby oxacilin, u močových infekcí
cefalosporiny první generace.
 Makrolidy jsou na místě jen u alergických osob,
linkosamidy mají význam u infekcí pohybové soustavy a
aminoglykosidy raději jen v kombinaci.
 Glykopeptidová antibiotika (vankomycin a teikoplanin)
jsou v rezervě. Používají se u kmenů rezistentních na
oxacilin, takzvaných MRSA a MRSKN. Pokud by byl
stafylokok rezistentní i na ně, nebo pokud pacient toxické
glykopeptidy nemůže užít, lze také použít linezolid a další
nové látky.
MRSA a jejich detekce
 Methicilin rezistentní stafylokoky (MRSA) jsou
epidemiologicky závažné kmeny, často způsobující
nozokomiální infekce.
 Příčinou je změna tzv. penicillin binding proteins (PBP).
 Na problém upozorní malá zóna u oxacilinu.Ta však může
být způsobena i jinými vlivy.
 Za průkazné se považuje, je-li malá zóna nejen u oxacilinu,
ale i u cefoxitinu.
Přehled úkolů – diagnostika stafylokoků
 MikroskopieVZORKU hemokultury – úkol 1
 Mikroskopie předložených KMENŮ – úkol 2
Po druhém úkolu poznáme grampozitivní koky.
 Popis kolonií na krevním agaru – úkol 3
 Růst na KA s 10 % NaCl – úkol 4
 Katalázový test – úkol 5
Po těchto úkolech odlišíme stafylokoky od ostatních.
 Odlišení zlatého stafylokoka od koaguláza negativních druhů
– úkoly 6 a, b, c.
 Druhové určení stafylokoka – úkol 7
 Testování citlivosti na atb – úkol 8a, b
Úkol 1: Mikroskopie vzorku
 Prohlédněte si mikroskopický preparát hemokultury,
obarvený podle Grama. (Nezapomeňte přikápnout imerzní
olej! Použijte objektiv imerzní, 100×)
 Pátrejte po grampozitivních kocích ve shlucích, a také po
erytrocytech.
Foto: O. Z.
Úkol 2: Barvení kultur podle Grama
 Obarvěte podle Grama čtyři podezřelé kmeny (pro
zopakování: natřít, nechat uschnout, fixovat plamenem,
poté barvit: Gram 30 s, Lugol 30 s, alkohol 15 s, voda,
safranin 60 s, voda, osušit, imerzní olej, imerzní objektiv
zvětšující 100×).
 Jednoho podezřelého vyloučíte snadno: bude to Gtyčinka.
Další tři podezřelí budou G+ koky a spolehlivě
je tedy mikroskopií nedokážete rozlišit… Musíte
postupovat dál
Úkol 3: Popis kolonií na KA
 Pečlivě si prohlédněte zbylé tři kmeny grampozitivních
koků. Prohlédněte si i kmen gramnegativní tyčinky,
všimněte si, jak moc se od koků její kolonie liší.
 Popište všechny vlastnosti kolonií a zvlášť si všímejte
těch vlastností, které odlišují stafylokoky od ostatních
grampozitivních koků (výrazný pigment, konzistence).
Úkoly 4 a 5: Určení stafylokoka
 V úkolu 4 odhalíme stafylokoka tím, že roste na KA s 10
% NaCl, kdežto ostatní nikoli.
 V úkolu 5 odhalíme stafylokoka katalázovým testem
(kolonie vmícháme do kapky peroxidu vodíku). Pokud
šumí, je to stafylokok.
Úkoly 6a, b a c: Odlišení S. aureus od
CoNS
 Úkol 6 a) – clumping factor neboli vázaná
plasmakoaguláza (zůstává součástí těla mikroorganismu).
 Úkol 6 b) – volná (plasma)koaguláza (říká se jí „volná“,
protože je to molekula enzymu, bakterií uvolňovaná do
prostředí).
 Komerční testy provádět nebudeme
 Úkol 6 c) – hyaluronidáza (dekapsulace).
6 a): Clumping factor neboli také vázaná
plasmakoaguláza – rychlé
 Kolonie se vmíchají do kapky králičí plasmy na
podložním sklíčku.
 Pozitivita se projeví jako tvorba shluků v kapce
plasmy (viz obrázek na další obrazovce).
 Nejde vlastně o KOAGULACI, ale o AGLUTINACI
plasmy.
 Test není příliš spolehlivý.
http://memiserf.medmikro.ruhr-uni-bochum.de
6 b): Volná koaguláza – klasika
 Nejklasičtější z testů pro odlišení zlatého stafylokoka
(koaguláza pozitivního stafylokoka).
 Kličkou nabrané kolonie vmícháme do králičí plasmy ve
zkumavce.
 Pokud plasma koaguluje (má konzistenci želé), je kmen
koaguláza pozitivní.
http://microbiology.scu.edu.tw
Dejte pozor, co nakreslíte do protokolu!
 Důležité je zakreslit, že negativní výsledek znamená, že ve
zkumavce zůstává vodorovná hladina.
 Při pozitivním výsledku se tekutina buďto celá změní na
konzistenci želé, nebo popř. je patrno „želé“ uvnitř
tekutiny, viz obrázky.
Komerční testy, např. Staphaurex (v
praktiku je neprovádíme)
 Provedením
připomínají clumping
factor, ale jsou
spolehlivější než volná
plasmakoaguláza.
 Jsou bohužel poměrně
drahé. www.microbes-edu.org
Souprava Staphaurex a výsledky
http://www.pathologyinpractice.com www.microbes-edu.org
6c: Hyaluronidáza (test dekapsulace –
„odpouzdření“)
 Elegantní test, jehož principem je skutečnost, že
hyaluronidáza, produkovaná zlatým stafylokokem (ne
však koaguláza negativními stafylokoky) rozpouští
pouzdro (kapsulu) opouzdřených bakterií. Používá se
druh streptokoka Streptococcus equii, pro člověka
nepatogenní.
 Ztráta pouzdra se projeví změnou vzhledu
streptokoka (ztráta „hlenovitosti“).
Foto: O. Z.
Foto: O. Z.
Co tedy musíme prakticky provést
 V úkolu 6 a) provedete clumping faktorový test, když
kolonie vmícháte do kapky plasmy.
 V úkolu 6 b) si prohlédneme výsledek testu
plasmakoagulázy, který byl připraven včera. Odečítá se
orientačně po 4 h a spolehlivě až po 24 h. Pozitivní je
koagulovaná tekutina.
 V úkolu 6 c) si prohlédneme včera připravený
hyaluronidázový test. Pozitivní je kmen, který „rozpouští
slizovitost“ pásu streptokoka.
Úkol 7: rozlišení stafylokoků
 V úkolu 7 provedete STAPHYtest 16 podle návodu, čímž
jednak ověříte identitu zlatého stafylokoka a jednak určíte
toho druhého.
 Za normálních okolností zlaté stafylokoky
STHAPHYtestem neurčujeme, stačí nám testy z úkolů 6a,
b a c, popřípadě komerční testy.
 Test tedy slouží k diagnostice koaguláza negativních
stafylokoků.
STAPHYtest 16 – jak ho odečíst
 Pozor – i když se jmenuje STAPHYtest 16, zahrnuje ve
skutečnosti 17 reakcí. Jako první se odečítá testVPT ve
zkumavce. Červená tekutina ve zkumavce = pozitivní
VPT, bezbarvá tekutina = negativní.
 První řádek STAPHYtestu = 2.–9. reakce
 Druhý řádek STAPHYtestu = 10.–17. reakce
 Vypočítejte kód a porovnejte s kódovníkem.
 Kód je šestimístný. Prvních pět číslic je ze trojic testů,
šestá číslice je z dvojice.
Výsledek – první kmen
(703 651 = S. aureus, 99,8 %, Tin=1,00)
1 2
H
3
G
4
F
5
E
6
D
7
C
8
B
9
A
10
H
11
G
12
F
13
E
14
D
15
C
16
B
17
A
První řádek panelu Druhý řádek panelu
+ S l l l l l l l l l l l l l l l l
- S l l l l l l l l l l l l l l l l
? S l l l l l l l l l l l l l l l l
+ + + - - - + + - - + + + - + + -
1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2
7 0 3 6 5 1
Zkum
Výsledek – druhý kmen
(703 241 = S. epidermidis, 97,95 %, Tin=1,00)
1 2
H
3
G
4
F
5
E
6
D
7
C
8
B
9
A
10
H
11
G
12
F
13
E
14
D
15
C
16
B
17
A
První řádek panelu Druhý řádek panelu
+ S l l l l l l l l l l l l l l l l
- S l l l l l l l l l l l l l l l l
? S l l l l l l l l l l l l l l l l
+ + + - - - + + - - + - - - + + -
1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2
7 0 3 2 4 1
Zkum
Úkol 8a: testy citlivosti
 Odečtěte difusní diskový test – změřte zóny a porovnejte
s referenčními zónami.
 Máte k dispozici šestici antibiotik (FOX = cefoxitin, DA =
klindamycin, E = erythromycin, SXT = ko-trimoxazol,TE =
tetracyklin, C = chloramfenikol; v praxi se používají dvě
šestice, označované S1 a S2, my máme test S1).
 Každý set je proveden na kmen STKN (koaguláza
negativního stafylokoka) a STAU (zlatého stafylokoka).
Test citlivosti u zlatého a
koagulázanegativního stafylokoka
FotoVeronika Holá
Zóny citlivosti některých běžných
protistafylokokových antibiotik
Antibiotikum Zkr. „C“ je-li ≥
než
(mm)
„I“ je-li
mezi (mm)
„R“ je-li <
než (mm)
Cefoxitin (cefalosporin);
interpretace: oxacilin a další
CXT ≥
22/25*
22/25*
*
Erythromycin (macrolid) E ≥ 21 18–20 < 18
Clindamycin (linkosamid) DA ≥ 22 19–21 < 19
Ko-trimoxazol (směs) SXT ≥ 17 15–16 < 15
Tetracyklin (tetracyklin) TE ≥ 22 19–21 < 19
Chloramphenikol C ≥ 18 < 18
*CXT: 22 mm S. aureus, 25 mm koagulázanegativní stafylokoky
Úkol 8b – vyhodnocení MRSA
 Máte několik kmenů na speciální screeningové půdě pro
MRSA (opakování z jarního semestru).
 Modré kolonie jsou kolonie kmenů MRSA.
 Růžové či bílé kolonie jsou methicilin rezistentní kolonie
jiných stafylokoků, než je S. aureus.
 Žádné kolonie znamenají, že jde o methicilin-citlivý
kmen.
Úkol 2a: Nativní preparát
 Zhotovte nativní preparát a pozorujte pod zvětšením
objektivem 40x (NE IMERZE!!!).
 Pozorujte, netřeba nic kreslit 
Úkol 3a: Mikrobiologické půdy
Úkol 3a: Mikrobiologické půdy
Po tomto cvičení byste měli znát:
 Diagnostika rodu Staphylococcus (odlišení od
strepktokoků, enterokoků; odlišení S. aureus a CoNS)
 Funkci volné a vázané plasmakoagulázy a její využití v
diagnostice
 Funkci hyaluronidázy a její využití v diagnostice
 Odečítání difúzních diskových testů a jejich
interpretace
 Základní mikrobiologické půdy a jejich použití