KLINICKÁ MIKROBIOLOGIE I PŘIROZENÁ MIKROFLÓRA praktikum č. 10 Lékařská mikrobiologie – cvičení Mikrobiologický ústav LF MU www.pinterest.com Obsah cvičení  Přirozená mikroflóra  Klinická mikrobiologie – význam  Indikace mikrobiologického vyšetření a léčby  Mikrobiologický vzorek – typ, odběr, transport  Vyplnění průvodky  Zpracování vzorku  Interpretace výsledku  Běžná flóra našeho těla = mikroflóra – tvořena saprofyty a komenzály.  Většinou prospěšné soužití – kolonizátoři brání osídlení sliznic patogeny.  Podílejí se na homeostáze prostředí – pH atd.  Střevní mikroorganismy pomáhají likvidovat nestravitelné zbytky a mohou tvořit některé vitamíny. Mikroflóra lidského těla  Mikroflóra se nachází především v:  Dutině ústní  Hltanu  Tlustém (a částečně i tenkém) střevě  Pochvě  Na kůži  Mikroflóra se nenachází ve:  Tkáních  Parenchymu orgánů  Krvi (!!!)  Plicích  Močovém měchýři  Děloze Mikroflóra lidského těla – výskyt  Plod – bez mikroflóry, kolonizace začíná až po narození.  První měsíce života – vývoj běžné mikroflóry (především střevní mikroflóra – změna potravy).  Ženy – změny ve skladbě mikroflóry vlivem menstruace, začátku pohlavního života, menopauzy.  Senioři – možné další změny, např. kolonizace dříve sterilního močového měchýře. Mikroflóra lidského těla – kolonizace Mikroflóra lidského těla – kolonizace Kůže, ušní boltec, zevní zvukovod Stafylokoky (i zlaté), korynebakteria, kvasinky) Ústní dutina a hltan Ústní streptokoky, neisserie, hemofily, omezeně pneumokoky, meningokoky, anaeroby Tlusté a tenké střevo Anaeroby, enterobakterie, enterokoky, Entamoeba coli Vagína Laktobacily, menší množství dalších mikrobů (např. kandidy) Přechody sliznic (např. rty) Směsná mikroflóra  Nosní dutina – bez specifické mikroflóry (přechod mikroflóry z kůže a hltanu).  Hltan – ústní streptokoky, neisserie, nevirulentní kmeny hemofilů. Mnohdy obtížně kultivovatelné.  Plíce a dolní cesty dýchací – fyziologicky bez mikrobů.  Hrtan – přechodová zóna, mikroflóra podobná hltanu, jen menší množství. Mikroflóra lidského těla – dýchací cesty  Rty – přechod kožní a ústní mikroflóry.  Ústní dutina – stejné jako hltan.  Jícen a žaludek – fyziologicky bez většího množství mikrobů.  Tenké a především tlusté střevo – cca 1 kg anaerobních bakterií (viz praktikum 7), dále enterobakterie, enterokoky, kvasinky, nepatogenní améby.  Řiť – přechodová zóna střevní a kožní mikroflóry. Mikroflóra lidského těla – trávicí cesty  Ústní dutina – velice složitý ekosystém „všeho možného“ – bakterie, usazeniny, lidské buňky...  Důležitá přítomnost biofilmu – vícedruhový, strukturovaný, výskyt aerobů i anaerobů (ty jsou zanořeny v hlubších vrstvách biofilmu). Mikroflóra lidského těla – ústní dutina  Ledviny – normálně bez mikrobů.  Pánvičky ledvinné – normálně bez mikrobů.  Močovody (uretery) – normálně bez mikrobů.  Močový měchýř mladých a středně starých osob – normálně bez mikrobů.  Močový měchýř seniorů – i za normálních okolností může být osídlen mikroflórou, která nečiní problémy a stává se „běžnou flórou“.  Močová trubice – vnější část může (nemusí) být osídlena jednak kožní mikroflórou, jednak i specificky (viridující streptokoky, aerokoky). Mikroflóra lidského těla – močové cesty  Za normálních poměrů nejsou mikroby:  U ženy v děloze, vejcovodech, vaječnících  U muže v prostatě, chámovodech, varlatech  Specifickou normální flóru má vagina (laktobacily, příměs různých aerobních i anaerobních mikrobů).  Vulva – přechod vaginální a kožní flóry.  U muže je specifický předkožkový vak, vedle kožní a urethrální flóry jsou tu i např. nepatogenní mykobakteria apod. Mikroflóra lidského těla – pohlavní cesty  Kůže – pro mikroby nejdostupnější, ale její osídlení mnohem chudší než v případě např. úst, pochvy či tlustého střeva.  Mikrob, který chce žít na kůži, musí snášet vyschnutí a vysoké koncentrace solí.  Na kůži se tedy normálně vyskytují  koaguláza negativní druhy stafylokoků  zlatý stafylokok – malé množství je normální  korynebakteria a příbuzné G+ tyčinky malá množství kvasinek Mikroflóra lidského těla – kůže Střevní mikroflóra – „péče“  Rekonvalescence průjmů nebo po celkové antimikrobiální terapii (kde mohlo dojít k vybití části mikroflóry) je vhodné snažit se o obnovu normálního stavu.  Používají se jogurty (nesladké, netučné), kyselé zelí, různé preparáty (Hylac).  Prebiotika – obsahují substráty pro „dobré“ bakterie  Probiotika – obsahují přímo dobré bakterie.  Symbiotika – obsahují obojí. Vaginální mikroflóra – „péče“  Narušení také po antimikrobiální terapii či při infekci.  Různé „lidové rady“ – aplikace jogurtu do pochvy apod.  Skutečně účinné – prebiotické a probiotické vaginální čípky.  Důležité je nepodcenit stravu (množství cukrů).  Velký vliv hraje také hormonální hladina – např. antikoncepce. Klinická mikrobiologie  Klinická mikrobiologie „v širším slova smyslu“ je lékařská mikrobiologie – tedy ta část mikrobiologie, která se týká mikrobiálního osídlení člověka a lidských patogenů (= obsah vaší zkoušky).  Klinická mikrobiologie „sensu stricto“ popisuje vlastní procesy mezi klinickým pracovištěm a laboratoří, jakož i organizaci vlastního laboratorního vyšetření. Je tedy orientovaná na jednotlivé orgány a systémy a tedy také jednotlivé typy vzorků. KLINIK LABORATOŘ Indikace vyšetření – zda, jaké Vlastní provedení odběru Transport materiálu Rozhodnutí, jak zpracovat Vlastní zpracování materiálu Zaslání výsledku Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález) Klinická mikrobiologie – vztahy Klinická mikrobiologie – indikace  Nutno si uvědomit, proč chci nechat pacienta vyšetřovat mikrobiologicky – změna terapie, život ohrožující stavy, epidemiologické či profylaktické indikace.  Co chci vlastně vyšetřovat – nezbytná znalost spektra patogenů a možností jejich vyšetřování. Klinická mikrobiologie – 3 typy patogenů  Patogen typu Streptococcus pyogenes – nemusím vědět, že myslím zrovna na tohoto patogena, ale musím přesně vědět, kde je jeho předpokládaná lokalizace.  Patogen typu Mycobacterium tuberculosis – musím vědět, kde patogena hledám, a zároveň i to, že hledám právě tuto skupinu patogenů – to tedy musím vyznačit na žádance.  Patogen typu Toxoplasma gondii – nemusím vědět, kde se patogen v těle nachází, ale musím vědět, že hledám právě jeho. Klinická mikrobiologie – 3 typy patogenů  Patogen typu Streptococcus pyogenes – týká se kultivovatelných bakterií a kvasinek, tedy většiny mikrobů z P01 až P06.  Patogen typu Mycobacterium tuberculosis – stále je to přímý průkaz, ale speciální postupy, při běžné kultivaci se nezachytí. Týká se zejména mikrobů z P07, P08, část P06.  Patogen typu Toxoplasma gondii – nepřímý průkaz, event. přímý průkaz virového antigenu. Týká se spirochet z P09, virů, ale i některých dalších (třeba zrovna toxoplasmy). Úkol č. 1  Pro následující kasuistiky zkuste vymyslet vhodné řešení. Zaměřte se přitom na následující otázky:  Bude užitečné vyšetřovat? Co to přinese pacientovi?  Bude účelné zvolit empirickou léčbu, cílenou léčbu (na podkladě mikrobiologického vyšetření), nebo vůbec neprovádět specifickou léčbu a pacienta léčit jen symptomaticky? Úkol č. 1 – kazuistika a)  Pacient se zarudlou, červenou mandlí a bělavým povlakem, podezření na angínu. http://www.medicalook.com Úkol č. 1 – kazuistika b)  Pacient s bolestivostí v oblasti obličeje, dle rtg zřejmě sinusitis, CRP vysoké (zřejmě tedy bakteriální původ), klinicky však není indikována punkce dutiny. http://www.drgreene.org Úkol č. 1 – kazuistika c)  Pacient s bolestivostí v oblasti zad, dle biochemických markerů vysloveno podezření na pyelonefritidu. http://www.bbc.co.uk Úkol č. 1 – kazuistika d)  Pacient s prokázanou pneumonií, u kterého již bylo provedeno vyšetření sputa a nebyla potvrzena přítomnost běžných patogenů. V anamnéze práce v živočišné výrobě. http://www.szote.u-szeged.hu Úkol č. 1 – kazuistika a) – závěr  Léčba bez mikrobiologického vyšetření je vždy špatná, protože dle studií je nejméně polovina tonsilitid virová (včetně infekční mononukleózy) a studie ukazují, že klinické vyšetření nestačí ke správné diagnóze.  Nutné je mikrobiologické vyšetření, popř. použití soupravy pro detekci S. pyogenes přímo v ordinaci.  V časové tísni alespoň CRP pro ověření bakteriální etiologie.  V léčbě při prokázané etiologii Streptococcus pyogenes (nebo aspoň prokázané bakteriální etiologii pomocí CRP) použijeme penicilin  Makrolidová antibiotika pouze u alergiků! Úkol č. 1 – kazuistika b) – závěr  Punkce není indikována ani mikrobiologicky (punktovat pacienta jen kvůli vyšetřování je nutno považovat za jeho zbytečné týrání).  Na druhou stranu není indikován ani výtěr z nosu, protože nalezené bakterie (často zlaté stafylokoky) se neshodují s patogenem přítomným v dutině (pneumokok, hemofil, moraxela).  V tomto případě lze tedy doporučit empirickou léčbu. Není-li důvod pro jinou volbu, měl by se použít amoxicilin. Úkol č. 1 – kazuistika c) – závěr  Nutné samozřejmě vyšetření moče.  Vhodné je však i hemokultivační vyšetření, které odliší systémového patogena od bakterií přítomných pouze v močovém měchýři, případně kontaminujících vzorek.  Léčba by měla být cílená.  Na rozdíl od cystitidy je při pyelonefritidě nutno volit preparáty, které se dostatečně koncentrují i ve tkáních a ne jen v moči (ne tedy například nitrofurantoin). Úkol č. 1 – kazuistika d) – závěr  Nutný odběr srážlivé krve a vyšetření séra na možné patogeny.  Navzdory anamnéze se zřejmě bude uvažovat i o běžných respiračních patogenech ze spektra původců atypických pneumonií (viry, mykoplasmata, chlamydie).  Je však vhodné doplnit o serologický průkaz tularémie, případně dalších zoonóz (například leptospirózy; pokud by šlo např. o zootechnika pomáhajícího v Africe, pak i např. brucelóza apod.).  Tyto fáze nelze oddělit – odběr je nutno činit již se zřetelem na transport materiálu do laboratoře.  V zásadě existují tři typy vzorků:  Výtěry a stěry na tamponech.  Tekuté a kusové vzorky, zasílané v nádobkách (zpravidla sterilních).  Jiné a speciální případy, viz dále.  Nelze zapomenout na správné vyplnění průvodky. Odběr a transport vzorku  Přednost má zpravidla zaslání tekutého/kusového materiálu před pouhým zasláním stěru/výtěru.  Existují četné výjimky:  v bakteriologii se zpravidla používá výtěr z řitního kanálu namísto kusové stolice (i když zaslání kusové stolice v zásadě není chyba).  stěr z uretry je u kapavky, ale i negonokokových urethritid (NGU) doporučován spíše než zaslání vzorku moče. Typ vzorku – tekutý či výtěr?  Suchý tampon – dnes se používá jen pro PCR a průkaz antigenu, ne pro kultivaci!  Amiesova půda s aktivním uhlím – univerzální transportní půda pro bakteriologii (všechny typy výtěrů). Drátěná varianta je vhodná, pokud se potřebujeme „dostat za roh“ (stěr z rány s výběžky apod.). Typy výtěrovek www.calgarylabservices.com, www.herenz.de  Fungi QUICK – modrý uzávěr, na kvasinky a houby  Souprava C. A. T. (Candida And Trichomonas) – pouze z genitálií  Na viry  Na chlamydie Typy výtěrovek www.copanswabs.com Přehled souprav na výtěry Suchý tampon na špejli: průkaz antigenu a DNA Suchý tampon na drátku: totéž, potřebuji-li se dostat na jinak nedostupné místo Tampon v Amiesu na špejli: univerzální pro bakteriologickou kultivaci (vč. anaerobů, kapavky, kampylobakt.) Tampon v Amiesu na drátku: totéž, potřebuji-li se dostat na jinak nedostupné místo Fungiquick – houby C. A. T. – houby a trichomonády (stěry z pohlaví) Soupravy s médiem na viry, popř. chlamydie  Odběrové nádobky se používají na kusové a tekuté vzorky. Na rozměrech fakticky příliš nezáleží, stejně tak barva uzávěru má význam jen v kontextu dodavatele. Pokud jsou dodávány např. sterilní zkumavky s červeným uzávěrem a nesterilní s bílým, je třeba se tím řídit. Pozor při změně dodavatele!  U anaerobní kultivace je lépe zaslat přímo stříkačku se speciálním uzávěrem (již tedy ne s jehlou).  Vzorky se snažíme vždy dopravit do laboratoře co nejdříve, zásadní je to však u moče – do dvou hodin. Odběrové nádoby  Odběrové nádobky se používají na kusové a tekuté vzorky. Na rozměrech fakticky příliš nezáleží, stejně tak barva uzávěru má význam jen v kontextu dodavatele. Pokud jsou dodávány např. sterilní zkumavky s červeným uzávěrem a nesterilní s bílým, je třeba se tím řídit. Pozor při změně dodavatele!  U anaerobní kultivace je lépe zaslat přímo stříkačku se speciálním uzávěrem (již tedy ne s jehlou).  Vzorky se snažíme vždy dopravit do laboratoře co nejdříve, zásadní je to však u moče – do dvou hodin. Odběrové nádoby Běžná zkumavka. Universální použití: srážlivá krev (serologie), moč, likvor, hnis, punktát apod.; krevní a močové katetry, menší kousky tkání… Sputovka. Nejen na sputum, ale např. i na větší kousky tkání Nádobka na stolice – na parazitologii. Pouze tato nemusí být sterilní! Nádobka na odběr moče. Je lepší, když pacient močí rovnou do zkumavky, avšak zvláště pro ženy je to obtížné (nejsou-li ve sprše). Mohou tedy močit do této nádobky, a pak sestra moč přelije do zkumavky. Odběrové nádoby  Nátěr na podložní sklíčko: kapavka, aktinomykóza, přímo zaslaná tlustá a tenká kapka apod.  V kožním lékařství a v epidemiologii - otisky přímo na kultivační půdu, která je pro tento účel nalita až po okraj Petriho misky; v chirurgii otisk na filtrační papír který je pak přiložen na misku s kultivační půdou  Urikult – zvláštní způsob zasílání moče v soupravě obsahující kult. půdy; z různých důvodů se příliš neujalo.  Rychlé diagnostické soupravy – většinou založené na přímém průkazu antigenu; jednoduchá manipulace, dostupná i pro nemikrobiologický personál. Při pochybách o výsledku použít klasické zaslání do laboratoře. Jiné typy odběrů (úkol č. 3)  Správně vyplněná průvodka je velice důležitá!  Osobní údaje: podstatné kvůli pojišťovně, ale i kvůli identifikaci, komu poslat výsledek apod.  Přesný popis materiálu a požadovaného vyšetření:  nepsat pouze „výtěr“, když není jasné, odkud  ani „stěr z rány“ nestačí (jaká rána, kde lokalizována)  katetrizovaná moč × moč z permanentního katetru  uvést, zda je požadováno např. anaerobní vyšetření  nepožadovat vyšetření, které nelze provést nebo nemá smysl (např. kultivační vyšetření u syfilis) Vyplnění žádanky  Skutečnou diagnózu, je-li více, napsat tu, která souvisí s vyšetřením, popř. všechny /např. (1) diabetes mellitus, (2) poševní výtok  Akutní / chronický stav / kontrola po léčbě.  Uvést stávající nebo uvažovanou antibiotickou terapii, případně i alergii na antibiotika.  Cestovatelská anamnéza – návrat z tropů.  Pracovní anamnéza – práce v zemědělství aj.  U serologických vyšetření datum prvních příznaků, první / druhý vzorek.  U gynekologických materiálů fázi menstruačního cyklu (a při menses raději neodebírat) .  V případě mimořádných vzorků se dohodnout, telefonicky. Vyplnění žádanky – co uvést Nezapomeňte vyplnit na průvodce všechna důležitá pole:  pole popisující pacienta (jméno, rodné číslo, diagnóza, pojišťovna, oddělení…)  pole popisující vzorek (typ vzorku, lokalizace, okolnosti odběru)  a všechny ostatní významné části (zejména anamnézu) Vyplnění žádanky (úkol č. 4 a)  Pokuste se zjistit, které chyby jsou přítomny.  Častou chybou je nedostatečné označení typu vzorku.  Je také chybou požadovat vyšetření, které je nevhodné (například pátrání po protilátkách tam, kde převažuje buněčná imunita a protilátky nemají diagnostický význam). Vyplnění žádanky (úkol č. 4 b) – chyby  Výtěr z rány: nedostatečné, nutné přesnější uvedení typu rány a místa na těle.  Tkáň na mikrobiologii: naprosto nedostatečné, nutno více údajů.  Výtěr z rekta na parazitologii: nelze použít výtěr, nutno poslat kusovou stolici.  Kultivace syfilis: Treponemata nelze kultivovat. Vyplnění žádanky (úkol č. 4 b) – chyby  Je dáno standardními operačními postupy (SOP). Pro každý typ vzorku je dáno v SOP, jak má být vzorek zpracován a jaké metody na něj mají být aplikovány.  Ne vždy je ovšem vše dáno SOP. Zvláště ve vzácných a mimořádných případech je na rozhodnutí zkušeného laboranta či mikrobiologa, jak vzorek zpracovat.  V důležitých případech není naprosto chybou zatelefonovat do laboratoře a domluvit se. Zpracování vzorku  Vlastní zpracování zpravidla zajišťují laboranti, dříve se SŠ vzděláním, nyní s VOŠ nebo Bc. stupněm vysoké školy.  Postupuje se vždy přísně asepticky, aby se omezilo riziko laboratorní kontaminace. Práce v “biohazard boxu“ je zároveň i dobrou prevencí profesionálních nákaz Zpracování vzorku – vlastní zpracování  Zpracování bakteriologických kultivačních vzorků obvykle zahrnuje následující:  před vlastním zpracováním se některé vzorky homogenizují, centrifugují či jinak upravují  u některých typů vzorků rychlé postupy – mikroskopie, popř. přímý průkaz antigenu  téměř vždy je základem kultivace na několika pevných půdách (KA + Endo + popř. další)  někdy též pomnožení v tekuté půdě (v případě výtěrů ze spojivky POUZE tento bod)  Zpracování jiných vzorků (serologie, PCR, mykologie, parazitologie) je speciální a je dána typem vyšetření a povahou vzorku. Zpracování vzorku – vlastní zpracování  Zpracování bakteriologických kultivačních vzorků obvykle zahrnuje následující:  před vlastním zpracováním se některé vzorky homogenizují, centrifugují či jinak upravují  u některých typů vzorků rychlé postupy – mikroskopie, popř. přímý průkaz antigenu  téměř vždy je základem kultivace na několika pevných půdách (KA + Endo + popř. další)  někdy též pomnožení v tekuté půdě (v případě výtěrů ze spojivky POUZE tento bod)  Zpracování jiných vzorků (serologie, PCR, mykologie, parazitologie) je speciální a je dána typem vyšetření a povahou vzorku. Zpracování vzorku – vlastní zpracování  Výsledek je zaslán poté, co je dokončen diagnostický proces. Někdy je poslán předběžný výsledek („mezivýsledek“) po ukončení aerobní kultivace s tím, že to, co trvá delší dobu (kultivace kvasinek, anaerobů apod.) bude případně zasláno dodatečně.  Výsledek už v sobě zahrnuje kus interpretace: mikrobiolog se vyjadřuje k evidentním kontaminacím, náhodným nálezům, běžné flóře, komentuje nález v poznámce. Zaslání výsledku  Definitivní interpretace nálezu je ovšem v rukou klinika. Pouze on, nikoli mikrobiolog, totiž drží v.rukou vedle mikrobiologického nálezu také biochemický, rentgenový, ultrazvukový, a především zná pacienta – zná anamnézu, vyšetřil jej, popřípadě (u obvodních lékařů) jej zná dlouhodobě.  Samozřejmě, konzultace klinika a mikrobiologa je u závažných případů velice vhodná. Na druhou stranu nelze konzultovat každý nález. Interpretace výsledku  Patogen – mikrob nalezený přímým průkazem může být patogenem. Není jím ale vždy.  Součást běžné flóry – důvod, proč je třeba znát normální osídlení v různých lokalizacích.  Náhodný nález (= součást transientní běžné flóry). Příklad: malá množství enterobakterií ve výtěru z krku, zvláště u ambulantních pacientů – normální.  Kolonizující mikrob – zejména u výtěrů z ran: mnohé mikroby ránu jen kolonizují.  Kontaminace během odběru, transportu apod. Interpretace přímého průkazu Interpretace přímého průkazu – úkol 5a Nález Pravděpodobně je to Streptococcus pyogenes ve výtěru z krku patogen Neisseria lactamica ve výtěru z krku běžná flóra Escherichia coli (významné množství) v moči patogen Escherichia coli ve stolici běžná flóra Bacillus sp. ve stěru z kůže kontaminace Staphylococcus epidermidis ve stěru z kůže běžná flóra Staphylococcus epidermidis opakovaně ve vzorku z krevního řečiště patogen Interpretace přímého průkazu – úkol 5a Nález Pravděpodobně je to Pseudomonas aeruginosa v ráně, kde byl zároveň nalezen Streptococcus pyogenes kolonizace (streptokoka léčit celkově, pseudomonádu jen lokálně) Entamoeba histolytica ve stolici patogen Entamoeba coli ve stolici náhodný nález Aspergillus sp. v malém množství v kožní šupině kontaminace z prostředí Trichophyton mentagrofytes v kožní šupině patogen Rotavirus ve stolici patogen  Akutní infekce – charakterizována pozitivitou IgM protilátek, čtyřnásobným vzestupem titru, nízkoavidními protilátkami. Avšak někdy ani to vše nestačí – může např. jít o zkříženou reaktivitu.  Nemoc v minulosti – zpravidla pouze IgG pozitivita a nízký, neměnící se titr. Bohužel ani zde ne vždy jednoznačně platí.  Chronická nemoc – někdy velmi obtížná interpretace. U hepatitidy B je velký rozdíl mezi jednotlivými formami chronické hepatitidy. Interpretace nepřímého průkazu Klinická situace Výsledky serologie Interpretace Těhotná žena bez problémů Toxoplasma IgG +, IgM –, KFR pozitivní, titr 1 : 10 opakovaně Není nyní nakažena, zřejmě infekce dříve, má výhodu, protože je chráněna Senior s příznaky toxoplasmové retinitidy Toxoplasma IgG –, IgM –, KFR negativní Vzhledem k příznakům nelze infekci vyloučit. Je nutné další vyšetřování Pacient se žloutenkou VHA aVHC kompletně negativní, HBsAg, HBeAg a anti-HBc igM pozitivní Akutní hepatitida B Jiný pacient se žloutenkou VHA kompletně negativní, anti-HBs, anti-HBe a anti-HCV IgM pozivitní Akutní hepatitida C; hepatitida B v minulosti Pacient s erythema migrans Protilátky proti borreliím kompletně negativní Nutná léčba, možná příliš čerstvá infekce Interpretace nepřímého průkazu – úkol 5b