Téma: Analýza cytotoxických účinků chemoterapeutických látek na karcinomy Úvod: Základní výzkum v oblasti protinádorové terapie se často zaměřuje na hledání způsobů, jak indukovat terminální diferenciaci, programovanou buněčnou smrt nebo zastavit proliferaci nádorových buněk. Například při hledání nových léčiv je prvním, nejjednodušším a nejlevnějším krokem sledování vlivu studovaných agens na základní fenotypové vlastnosti nádorových buněčných linií, jakými jsou právě míra proliferace, viabilita a morfologie. V tomto cvičení se zaměříme na metody používané ke stanovení viability buněk a typu buněčné smrti. Chemoterapeutika, která budeme používat: 5’fluorouracil je pyrimidinový analog patřící mezi antimetabolity. Fluorouracil inhibuje thymidylát syntázu a inkorporuje se do RNA místo uracilu. Maximální účinnost látky je pozorována v tkáních s rychlým dělením buněk (kostní dřeň, kůže, sliznice). Cis‑platina (CDDP, cis‑diamindichlorplatina) je tradičním chemoterapeutikem v léčbě různých typů nádorů. Vazba CDDP na DNA vyvolává vznik vnitrořetězcových a meziřetězcových křížových vazeb, které brání replikaci DNA. Doxorubicin patří mezi antracyklinová antibiotika a je běžně používán jako chemoterapeutikum i jako imunosupresivní činidlo. Intarkaluje se do DNA, inhibuje funkci reverzní transkriptázy a RNA polymerázy. Úloha č. 1 STANOVENÍ DENZITY BUNĚK BARVENÍM KRYSTALOVOU VIOLETÍ Působením toxických látek dochází k zástavě buněčného dělení případně k indukci smrti buněk, která je spojena se ztrátou kontaktu s podkladem. Nejjednodušším testem toxicity je barvení krystalovou violetí, kdy dojde k obarvení buněk, které zůstaly přisedlé na podkladu. 1. Nasadit buňky MDA-MB-231 o hustotě (8x10^5buněk / 2 ml = jamku) na 6-jamkové destičky. 2. Přidat testované látky 3. Inkubace při 37°C/10% CO[2] 4. Odsát médium, buňky jemně opláchnout 1xPBS. 5. Jemně napipetovat ledový MeOH tak aby byla pokryta celá plocha misky 6. Fixace 10 min./-20°C 7. Odsát methanol, napipetovat 0,4% roztok krystalové violeti v metanolu, tak aby byla pokryta celá plocha misky 8. Barvit 1 hod. při pokojové teplotě 9. Odsát krystalovou violeť a důkladně odstranit zbytky barvy, vysušit 10. Lyzovat roztokem 10% kyseliny octové, 1h 11. Měřit na spektrofotometru při 570nm Úloha č. 2 STANOVENÍ VIABILITY PRŮTOKOVOU CYTOMETRIÍ 1. Nasadit buňky MDA-MB-231 o hustotě (8x10^5buněk / 2 ml = jamku) na 6-jamkové destičky. 2. Přidat testované látky 3. Inkubace při 37°C/10% CO[2] 4. Odsát médium, buňky jemně opláchnout 1xPBS. 5. Buňky z pokusné misky centrifugovat (400g/5 min) 6. Odsát supernatant, pelet resuspendovat v 0,5 ml 1Xpbs, přidat 1ul roztoku PI (500ug/ml) 7. Analyzovat na cytometru. Úloha č.3 Fixace buněk a barvení nukleových kyselin propidium iodidem Buňky se po inkubaci s daným cytotoxickým agens fixují ve směsi metanolu s kyselinou octovou, čímž se permeabilizuje jejich buněčná membrána a barvivo může proniknout dovnitř buněk. Po přidání propidium iodidu dojde k obarvení nukleových kyselin. Vyhodnocuje se morfologie buněčného jádra, stupeň kondenzace chromatinu, přítomnost fragmentace jádra a apoptotických tělísek. Tímto testem identifikujeme formu buněčné smrti, konkrétně detekujeme frekvenci apoptotické buněčné smrti. Postup: 1. Indukovat buněčnou smrt buněk MDA-MB-231 inkubací s testovanými látkami (v 5 ml miskách, 2x10^6 buněk) 2. Předem připravit směs složenou z metanolu a ledové kyseliny octové v poměru 3:1, směs uchovávat v –20°C a používat vychlazenou. 3. Buňky z pokusné misky centrifugovat (400g/5 min) 4. Odsát supernatant, pelet resuspendovat v 0,5 ml 1xPBS 5. Za současného míchání na vortexu pomalu přikapat 5 ml ledové směsi 6. Inkubovat v –20°C minimálně 30 minut (optimálně přes noc) 7. Centrifugovat při 150g/5 min (fixované buňky jsou křehké, nepoužívat při centrifugaci vyšší otáčky!) 8. Odsát supernatant, pelet resuspendovat ve 100 ml ledové směsi 9. Kápnout jednu kapku na podložní sklíčko a nechat zaschnout 10. Obarvit 10 ml propidium iodidu o koncentraci 10 mg/ml 11. Přikrýt krycím sklíčkem, vyhodnotit pod fluorescenčním mikroskopem procento jader s apoptotickou morfologií Úloha č.4 Detekce ŠtĚpenÍ PRoteinu PARP pomocí elektroforézy proteinů a immunoblotingu V průběhu apoptózy dochází k aktivaci efektorových kaspáz, jejichž substrátem je mimo jiné poly(ADP-ribosa) polymeráza (PARP). V apoptotických buňkách vzniká specifický fragment proteinu PARP (89 kDa). Postup: Příprava vzorků: Indukovat buněčnou smrt buněk MDA-MB-231 testovanými látkami. Buňky promýt 1xPBS a lyzovat v 2xCSB pufru s přídavkem merkaptoethanolu, 4 minuty povařit a uchovávat při –20 ^oC. Příprava gelu: 1. S použitím rukavic vyčistit skla, promýt pod tekoucí vodou, umýt detergentem, propláchnout vodou, opláchnout ethanolem a utřít. 2. Sestavit skla se spacery a sevřít je svorkami. 3. Připravit roztok pro dolní gel, jemně promíchat a nalít mezi připravená skla asi do 2/3. Převrstvit gel slabou vrstvou destilované vody. Nechat polymerovat 30 minut. 4. Slít horní vrstvu destilované vody, připravit roztok pro horní gel, nalít jej na dolní gel, vsunout hřebínek a nechat polymerizovat 45 minut. Nanášení vzorků a elektroforéza: 1. Skla s gelem umístíme do elektroforetické aparatury, dolijeme elektroforetický pufr a opatrně vytáhneme hřebínky. 2. Na gel nanášíme 10-20 ul vzorku (množství závisí na koncentraci proteinů v buněčných lyzátech). 3. Připojíme aparaturu ke zdroji. Pro průchod horním gelem aplikujeme 80V, poté zvýšíme napětí na 120V. 4. Elektroforézu zastavím v momentě, když hrana barvičky opouští gel. Sestavení blotovací aparatury: 1. Nastříháme 4 kusy papíru Whatman 3MM a polyvinyldifluoridovou (PVDF) membránu stejné velikosti jako je proteinový gel. 2. Polyvinyldifluoridovou (PVDF) membránu dehydratujeme 5min v metanolu. 3. Navlhčíme papíry Whatman a pórézní podložky v transferovém pufru. 4. Plastikovou svorku umístíme do vaničky s transferovým pufrem černou plochou dolů. Na ní položíme pórezní podložku a vytlačíme bubliny. 5. Na podložku umístíme 2 navlhčené filtrační papíry Whatman a opět vytlačíme bubliny. 6. Na papíry Whatman položíme gel a na něj opatrně dehydratovanou PVDF membránu. 7. Na membránu pak opět položíme dva papíry Whatman, vytlačíme bubliny a na ně druhou pórézní podložku. Opět vytlačíme bubliny. 8. Takto sestavený sendvič sevřeme do plastikové svorky a umístíme do vaničky s transferovým pufrem a chladítkem. 9. Blotujeme 1,5 hod při 400 mA. Detekce proteinů na membráně pomocí protilátek: 1. Po skončení blotingu promyjeme PVDF membránu v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween po dobu 30 minut při pokojové teplotě nebo přes noc při 4^ oC. 2. Inkubujeme membránu s primární protilátkou anti-PARP ředěnou 1:2000 v TBS-Tween 1 hod při pokojové teplotě nebo přes noc při 4^ oC. 3. 3x promyjeme v TBS-Tween (cca 5 minut každé promytí). 4. Inkubujeme membránu 1 hod se sekundární protilátkou s konjugovanou alkalickou fosfatázou (anti-rabbit IgG ředěná 1:15000 v TBS-Tween) při pokojové teplotě. 5. Promyjeme dvakrát TBS-Tween (5min) a dvakrát TBS (2min). 6. Opláchneme membránu v destilované vodě. 7. Membránu inkubujeme ve vyvolávacím roztoku (10 ml AP pufru, 33 ul NBT, 83 ul BCIP) Použité roztoky Transferový pufr: TBS: TBS-Tween: 48 mM Tris 50 ml 1M Tris-Cl pH=8.0 přidat 1,5 ml Tween 20 do 2 litrů TBS 39 mM glycin 57,6 ml 5M NaCl 20%methanol doplnit vodou do 2 litrů Odbarvovací roztok: Tris-glycin elektroforetický pufr (ph=8,3): 500 ml metanolu 25 mM Tris 400 ml destilované vody 250 mM glycine 100 ml kyseliny octové 0,1% (w/v) SDS Pufr pro alkalickou fosfatázu: Barvící roztok: (barvení proteinů) 1ml 1M Tris-CL, pH=9, 200 ul 5M NaCl 2,5 g Coomassie Blue na 1L odbarvovacího roztoku 50 ul 1M MgCl[2] doplnit destilovanou vodou do 10ml Dolní (dělící) gel – 10% (10ml) Horní (zaostřovací) gel – 4% (7,5ml) H[2]O 4,9 ml H[2]O 5,62 ml 40% Akrylamid 2,4 ml 40% Akrylamid 0,79 ml 1,5M Tris-Cl (pH=8,8) 2,5 ml 1,5M Tris-Cl (pH=6,8) 0,94 ml 10% SDS 0,1 ml 10% SDS 75 ul Ammonium persulfate 75 ul Ammonium persulfate 30 ul TEMED 7,5 ul TEMED 10 ul 2xCSB lyzační pufr 6,9 ml H[2]O 2 ml glycerol 1,2 ml 1M Tris pH=6,8 0,4 ml 0,2% Bromfenolová modř v 1M Tris pH=6,8 2 ml 20% SDS + před použitím přidat 100 ul beta-merkaptoethanolu k 900 ul 2x CSB Úloha č.5 MĚŘENÍ HLADINY KYSLÍKOVÝCH RADIKÁLŮ SONDOU DHE PRŮTOKOVOU CYTOMETRIÍ Oxidativní stres je důležitou charakteristikou nádorové buňky a také jednou z mnoha událostí, která může vyvolat vnitřní cestu aktivace apoptózy. Oxidativní stres je podmíněn přítomností kyslíkových radikálů, které vznikají při mnoha chemických reakcích probíhajících v těle. Radikál je chemické označení pro prvek nebo sloučeninu, která ve své molekule obsahuje jeden nebo více nespárovaných elektronů. Radikály bývají velmi nestabilní a vytrhávají elektrony z jiných sloučenin, tím pak poškozují buňky organismu. Poškození se týká povrchových membrán buněk i vnitrobuněčných struktur včetně buněčných jader. DHE je fluorescenční sonda, které monitoruje přítomnost superoxidových aniontů. Reakcí DHE se superoxidy vzniká hydroxyethidium. Superoxidy detekujeme jako zelený fluorescenční signál při použití excitační/emisní vlnové délky 488/520 nm. 1. Adherentní buňky T47D převést do suspenze, spočítat. Nasadit na 6-jamkové destičky v koncentraci 0,15*10^5/2ml. 2. Inkubace buněk 24h/37°C 3. Vystavení buněk cisplatině, doxorubicinu 4. Inkubace buněk 24h/37°C 5. Sterilně odsát médium od buněk. 6. Namíchat si roztok média se sondou DHE o výsledné koncentraci 10uM (zásobní koncentrace DHE 50mM) 7. Dvakrát promýt v 1xPBS 8. Napipetovat opatrně na buňky médium se sondou 9. Inkubace v temnu při 37°C/20 min 10. Odsát médium, dvakrát promýt v 1xPBS 11. Přenos buněk suspendovaných v 0,5 mL 1x PBS do FC zkumavek 12. Měření na průtokovém cytometru FACSVerse Úloha č.6 STANOVENÍ ZMĚN V DISTRIBUCI BUNĚK V BUNĚČNÉM CYKLU Ovlivnění nádorových buněk chemoterapeutiky může být doprovázeno změnami v regulaci buněčného cyklu.Tyto změny lze sledovat analýzou obsahu DNA v buňkách po obarvení propidium jodidem pomocí průtokového cytometru FACSVerse. Propidium jodid je interkalující barvivo, které se váže k DNA a po ozáření světlem o vlnové délce 488 nm emituje záření (> 560 nm). Množství navázaného barviva je úměrné množství DNA v buňce. Z jednoparametrové analýzy fluorescenčního signálu propidium jodidu je možné určit obsah DNA v buňkách a tím i fázi buněčného cyklu, ve které se nacházejí. Při indukci apoptózy můžeme buňky detekovat v subG0 fázi buněčného cyklu. Postup: 1. Adherentní buňky MDA-MB-231 trypsinizací převést do suspenze, spočítat. Nasadit na 5ml misky v koncentraci 1*10^5/ml. 2. Následující den přidat k buňkám chemoterapeutikum 3. Po 48 hod působení, odsát médium, sklidit buňky 1 mM EDTA v PBS, centrifugace 500g/5min 4. Buňky promýt 1xPBS 5. Pelet rozsuspendovat v 0,5 ml PBS a přikapat 4 ml vychlazeného 70% etanolu 6. Fixace min. 30 min v 4°C 7. Centrifugace 500g/5 min, odsát supernatant 8. Promýt 4 ml 1xPBS 9. Rozsuspendovat ve Vindelově roztoku (obsahuje propidium jodid a RNázu) 10. Barvit 30 min, 37°C, v temnu 11. Analýza množství DNA průtokovým cytometrem Úloha č.7 ANALÝZA INTEGRITY DNA in vitro Pufr: 0,1 M roztok fosforečnanů draselných,pH 7,4: 80,2 ml 1 M K[2]HPO[4] 19,8 ml 1 M KH[2]PO[4] 900 ml H[2]O Pracovní postup: 1. Připravit roztok fosforečnanů draselných a rozdělit do testovacích mikrozkumavek po 100 ml. 2. Do každé mikrozkumavky přidat 1 mg plazmidu puC18. 3. Do mikrozkumavek přidat varianty testovaných látek a/nebo induktory oxidativního stresu. 4. Inkubovat 90 minut při laboratorní teplotě. 5. Vhodné množství vzorku nanášet na agarózovou elektroforézu a ověřit integritu plazmidu. Agarózová elektroforéza 1. Agarózu v roztoku zcela rozvařit v mikrovlnné troubě. 2. Za občasného míchání nechat roztok zchladit na cca 60°C. 3. Do roztoku pipetovat 5 ml etidium bromidu. 4. Roztok nalít do vaničky a zasunout hřebínky. Gel nechat nejméně 30 minut polymerizovat. 5. Vaničku s gelem přesunout do elektroforetické aparatury naplněné 1xTAE pufrem, do jamek nanášet vhodné množství vzorků smíchaných s 1 ml nanášecího pufru. 6. Elektroforézu spustit při konstantním napětí 80 V. 7. Gel přesunout do systému na dokumentaci a vizualizaci gelů (SynGene) a štěpení vzorků odečíst pomocí programu GeneSnap (SynGene) na PC.