Téma: buněčná diferenciace Úvod: Během diferenciace buněk dochází k výrazným změnám v expresi a aktivitě celé řady proteinů. Tyto změny mohou být kvalitativní (syntéza proteinu, který v prekurzorech nebyl exprimován) nebo kvantitativní (změna v množství syntetizovaného proteinu). Diferenciace může být také doprovázena změnami v lokalizaci či post-translačních modifikacích určitých proteinů ovlivňujících jejich aktivitu. Důsledkem diferenciace jsou funkční změny buněk, které úzce souvisí se změnami jejich morfologie, proteinového/enzymového vybavení a se změnami proteinových markerů vystavených na jejich povrchu. Cílem této úlohy je osvojení poznatků týkajících se procesů provázejících diferenciaci hematopoietických buněk myeloidní řady a praktická aplikace těchto vědomostí při sledování diferenciace monoblastů BM2 do monocytů/makrofágů. Cíl: Definovat změny v expresi, lokalizaci a specifické aktivitě vybraných proteinů během makrofágové diferenciace monoblastů BM2. Úloha č.1 Detekce vimentinu v lyzátech monocytů BM2 pomocí elektroforézy proteinů a immunoblotingu Vimentin: Cytoskeletární protein o velikosti 57 kDa. Patří do skupiny intermediárních filament. Exprimován v buňkách mezodermálního původu. Jeho intracelulární hladina se mění během diferenciace některých typů buněk. SDS elektroforéza proteinů: - dělení proteinů dle jejich molekulové hmotnosti (pro určení MW využití markeru) - migrace ovlivněna i modifikacemi proteinů (př. glykosylace …) - nejčastěji se používá diskontinuální systém (rozdílné pH a iontová síla elektroforetického pufru, horního a dolního gelu) - horní a dolní gel (na jejich rozhraní dochází k zakoncentrování proteinů ze vzorku) - gel: polyakrylamid – polymerace akrylamidu, kroslinkováno N,N´-metylen-bis-akrylamidem - dělení proteinů dle MW – koncentrace gelu, počet kroslinků Elektroforetický pufr: Akrylamid a bisakrylamid – neurotoxin (pracujeme v rukavicích) SDS, Tris pufr Ammonium persulfát – poskytuje radikály pro polymerizaci TEMED (tetramethylethyléndiamin) – akceleruje polymeraci akrylamidu Vzorek: SDS se váže na proteiny – ty pak mají záporný náboj Redukční činidlo (merkaptoethanol, dithiothreitol) – disociace proteinových komplexů na podjednotky Barvení proteinů: Soli stříbra (nejcitlivější), Coomassie briliant blue – nespecifická vazba na proteiny Membrány: nitrocelulóza, PVDF, nylonové membrány - liší se kapacitou vazby proteinů, vážou různě různé proteiny - lze na ní i barvit proteiny (Ponceau S, India Ink, Amido Black …) Protilátky: Primární – monoklonální, polyklonální Sekundární – konjugované s enzymy (HRP, AP …), biotinylované … Substráty: Chromogenní, chemiluminiscence Příprava vzorků: 1x10^6 buněk BM2 inkubovat s forbolovým esterem TPA (7.5 ng/ml kultivačního media) v 5ml misce 24 hod. Zároveň kultivovat stejné množství BM2 buněk jako kontrolu. Buňky promýt 1xPBS a lyzovat v 2xCSB pufru neobsahujícím merkaptoethanol ani bromfenolovou modř, 4 minuty povařit a uchovávat při –20^oC. Změřit koncentraci proteinů ve vzorcích DC Protein Assay kitem (Biorad). Ke vzorkům přidat alespoň dvojnásobek kompletního 2xCSB pufru tak, aby výsledná koncentrace proteinů v takto naředěných vzorcích byla stejná. Měření koncentrace proteinů (DC Protein Assay Kit): Na mikrodestičku pipetovat 5ul každého vzorku ve třech opakováních. Ke vzorkům přidat 25 ul roztoku A´ (obsahuje 20 ul roztoku S na 1 ml roztoku A). Přidat 200 ul roztoku B, zbavit vzorky bublin a ponechat 15 minu stát. Poté změřit absorbanci na ELISA readeru při 750 nm. Vypočítat vhodné ředění vzorků tak, aby na SDS-PAGE bylo naneseno stejné množství proteinů od každého vzorku. Příprava gelu: 1. S použitím rukavic vyčistit skla, promýt pod tekoucí vodou, umýt detergentem, propláchnout vodou, opláchnout ethanolem a utřít. 2. Sestavit skla se spacery a sevřít je svorkami. 3. Připravit roztok pro dolní gel, jemně promíchat a nalít mezi připravená skla asi do 2/3. Převrstvit gel slabou vrstvou destilované vody. Nechat polymerovat 30 minut. 4. Slít horní vrstvu destilované vody, připravit roztok pro horní gel, nalít jej na dolní gel, vsunout hřebínek a nechat polymerizovat 45 minut. Nanášení vzorků a elektroforéza: 1. Skla s gelem umístíme do elektroforetické aparatury, dolijeme elektroforetický pufr a opatrně vytáhneme hřebínky. 2. Na gel nanášíme 10-20 ul vzorku (množství závisí na koncentraci proteinů v buněčných lyzátech). 3. Připojíme aparaturu ke zdroji. Pro průchod horním gelem aplikujeme 80V, poté zvýšíme napětí na 120V. 4. Elektroforézu zastavím v momentě, když hrana barvičky opouští gel. Barvení gelu na proteiny: 1. Gel ponoříme do barvícího roztroku a ponecháme na kývačce 1 hod. 2. Odlijeme barvící roztok a gel zalijeme roztokem odbarvovacím. Odbarvujeme opět na kývačce. Odbarvovací roztok měníme každých 20-30 minut. Po odbarvení gel vysušíme na sušičce gelů. Sestavení blotovací aparatury: 1. Nastříháme 4 kusy papíru Whatman 3MM a nitrocelulózovou membránu stejné velikosti jako je proteinový gel. 2. Navlhčíme papíry Whatman a pórézní podložky v transferovém pufru. 3. Plastikovou svorku umístíme do vaničky s transferovým pufrem černou plochou dolů. Na ní položíme pórezní podložku a vytlačíme bubliny. 4. Na podložku umístíme 2 navlhčené filtrační papíry Whatman a opět vytlačíme bubliny. 5. Na papíry Whatman položíme gel a na něj opatrně navlhčenou nitrocelulózovou membránu. 6. Na membránu pak opět položíme dva papíry Whatman, vytlačíme bubliny a na ně druhou pórézní podložku. Opět vytlačíme bubliny. 7. Takto sestavený sendvič sevřeme do plastikové svorky a umístíme do vaničky s transferovým pufrem a chladítkem. 8. Blotujeme 1 hod při 100 V. Detekce proteinů na membráně pomocí protilátek: 1. Po skončení blotingu promyjeme nitrocelulózovou membránu v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween po dobu 30 minut při pokojové teplotě nebo přes noc při 4^ oC. 2. Inkubujeme membránu s primární protilatkou anti-vimentin ředěnou 1:1000 v 5% roztoku sušeného mléka v TBS-Tween 1 hod při pokojové teplotě nebo přes noc při 4^ oC. (jako kontrolu nanášení použij anti-actin protilátku 1:1000). 3. 3x promyjeme v TBS-Tween (cca 7 minut každé promytí). 4. Inkubujeme membránu 1 hod se sekundární protilátkou s konjugovanou peroxidázou (anti-mouse IgG ředěná 1:10000 v TBS-Tween) při pokojové teplotě. 5. Promyjeme dvakrát TBS-Tween a dvakrát TBS. 6. Opláchneme membránu v destilované vodě, osušíme na ubrousku a umístíme na fólii. 7. Smícháme roztoky A a B z ECL kitu (Amersham) 1:1 a nakapeme na membránu. Inkubujeme 5 minut. 8. Osušíme membránu ubrouskem, přiklopíme folií a ve světlotěsné kazetě odneseme do temné komory. 9. Přiložíme fotografický papír a exponujeme 1 minutu (podle intenzity signálu upravíme délky dalších expozic) 10. Fotografický papír přeneseme do vývojky dokud se neobjeví signál. 11. Krátce opláchneme ve vodě a ponoříme jej na 5 minut do ustalovače. 12. Nakonec film promýváme alespoň 1 hodinu v destilované vodě a vysušíme. 13. Membránu můžeme následně obarvit nespecificky na proteiny roztokem amidové černi. Použité roztoky Transferový pufr: TBS: TBS-Tween: 48mM Tris 50 ml 1M Tris-Cl pH=8.0 přidat 1,5 ml Tween 20 do 2 litrů TBS 39mM glycin 57,6 ml 5M NaCl 20% methanol doplnit vodou do 2 litrů Odbarvovací roztok: Tris-glycin elektroforetický pufr (ph=8,3): 500 ml metanolu 25mM Tris 400 ml destilované vody 250mM glycine 100 ml kyseliny octové 0,1% (w/v) SDS Pufr pro alkalickou fosfatázu: Barvící roztok: (barvení proteinů na gelu) 1ml 1M Tris-CL, pH=9, 200 ul 5M NaCl 2,5 g Coomassie Blue na 1L odbarvovacího roztoku 50 ul 1M MgCl[2 ]- pro barvení proteinů na membráně:[ ] doplnit destilovanou vodou do 10 ml 1g amidové černi na 1L odbarvovacího roztoku Dolní (dělící) gel – 10% (10ml) Horní (zaostřovací) gel – 4% (7,5ml) H[2]O 4,9 ml H[2]O 5,62 ml 40% Akrylamid 2,4 ml 40% Akrylamid 0,79 ml 1,5M Tris-Cl (pH=8,8) 2,5 ml 1,5M Tris-Cl (pH=6,8) 0,94 ml 10% SDS 0,1 ml 10% SDS 75 ul Ammonium persulfate 75 ul Ammonium persulfate 30 ul TEMED 7,5 ul TEMED 10 ul 2xCSB lyzační pufr 6,9 ml H[2]O; 2 ml glycerol; 1,2 ml 1M Tris pH=6,8; 0,4 ml 0,2% Bromfenolová modř v 1M Tris pH=6,8; 2 ml 20% SDS + před použitím přidat 100 ul beta-merkaptoethanolu k 900 ul 2x CSB Úloha č.2 Detekce změn množství, lokalizace a strukturního uspořádání vimentinu během makrofágové diferenciace monoblastů BM2 pomocí nepřímé imunoflourescence Během makrofágové diferenciace dochází k nárůstu exprese proteinu intermediárních filament – vimentinu. Ten vytváří u makrofágů hustou bohatě rozvinutou síť vláken v cytoplazmě. Nepřímá imunoflourescence: - detekce množství, lokalizace a strukturního uspořádání proteinů ve fixovaných buňkách nebo tkáních - využití specifických primárních protilátek - sekundární protilátky fluorescenčně značené (FITC, rhodamin, texas red…) - fluorescenční molekula po excitaci zářením o určité vlnové délce emituje záření o jiné vlnové délce - fluorescenční mikroskop – excitační filtr (zářeni dopadajíci na preparát) - emisní filtr (filtruje záření vycházející z preparátu) - umožňuje detekci více proteinů naráz (více fluorescenčních molekul) - lze lokalizovat detekovaný protein do buněčných organel značených specifickými sondami Fixační média Fixace je operace, prováděná za účelem zastavení všech procesů, probíhajících v buňce, zachování co možná nejpřesnějšího stavu a struktury tkáně. Fixační činidlo je voleno podle řešeného diagnostického problému, typu a velikosti dostupného materiálu a podle zvolené zalévací a barvicí metody. Roztoky formaldehydu, paraformaldehydu, glutaraldehydu, methanol … Montovací média Pro ochranné účely a následné optimální mikroskopické vyšetření jsou obarvené buňky montovány vhodnými montovacími činidly. Použitý typ závisí na daném protokolu. Jedním z nejdůležitějších parametrů montovacích médií je index lomu (nD); musí být okolo 1,5, čímž odpovídá indexu lomu skla. Glycerol, Mowiol (Calbiochem), Vectashield (Vector), Flouromont-G (Sothern Biotechnology Associates) … Příprava vzorků 1x10^6 buněk BM2 inkubovat s forbolovým esterem TPA (7.5 ng/ml kultivačního media) v 5ml misce s krycím sklíčkem položeným na dno misky. Po 48 hod jsou buňky přisedlé na krycí sklíčko. Zároveň kultivovat stejné množství BM2 buněk jako kontrolu. Po 48 hod kontrolní buňky, které zůstávají v suspenzi, sklidit centrifugací při 400 g/65min. Buňky opláchnout roztokem PBS a 2x 10^5 buněk/600 ul cytocentrifugovat na krycí sklíčko 400 g/ 6 minut. Sklíčka s buňkami (kontrolními i po kultivaci s TPA) opláchnout v TBS a fixovat ledovou směsí aceton/metanol (1:1) 10 minut při 4^oC. Po fixaci promýt sklíčka s buňkami 3x 5 minut v TBS a inkubovat 1 hodinu s anti-vimentin primární protilátkou ředěnou 1:100 v TBS-Tween. Sklíčka promýt 3x v TBS-Tween a inkubovat v temnu 1 hodinu se sekundárním protilátkou konjugovanou s FITC ředěnou 1:100 v TBS-Tween. Sklíčka opět promýt – 2x TBS-Tween a 2x TBS. Na závěr inkubovat 5 minut v TBS s roztokem propidium iodidu (10 ug/ml) eventuálně Hoechst33342 (5 ug/ml) – barvení jader. Nakonec sklíčka opláchneme destilovanou vodou a montujeme na podloží sklíčka 2 ul Mowiolu (montovací medium od firmy Calbiochem). Preparáty pozorujeme ve fluorescenčním mikroskopu s vhodným emisním a excitačním filtrem pro FITC a PI. Použité protilátky a roztoky: TBS: TBS-Tween: 50 ml 1M Tris-Cl pH=8.0 přidat 1,5 ml Tween 20 do 2 litrů TBS 57,6 ml 5M NaCl doplnit vodou do 2 litrů Fixační směs: Montovací médium: Aceton:metanol 1:1 Mowiol (Calbiochem) Protilátky: myší monoklonální anti-vimentin protilátka (Sigma Aldrich) anti-myší IgG konjugovaná s FITC (Sigma Aldrich) Doplňková úloha – barvení buněčných struktur na živých buňkach – jádra a lysozomy Pro barvení struktur v živých buňkách lze využít flourescenční látky (sondy), které procházejí cytoplazmatickou membránou a následně se hromadí v určitém buněčném kompartmentu. Barvení může být úměrné některé z důležitých vlastností barvených organel (membránový potenciál u mitochondrií, acidifikace lysozomů …). Další alternativou jsou vektory pro expresi fůzních proteinů (protein se specifickou buněčnou lokalizací lokalizací + flourescenční protein). Existují pochopitelně i sondy pro detekci struktur ve fixovaných buňkách. Příklady: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/tables/Molecular -Probes-organelle-selective-probes.html Jádra – Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYTO Mitochondrie – MitoTracker red, MitoTracker orange, rhodamine 123, JC-1 Lysozomy – akridinová oranž, DND-153, DND-160 Hoechst 33342 – permeabilni, vazba na DNA do AT bohatych oblasti do maleho zlabku, excitace 350 nm, emise 461 nm Akridinová oranž – permeabilní, protonuje se v lysozomech, excitace 503 nm, emise 530 nm 4x10^5 buněk MDA-MB-231 inkubovat v 5ml misce s krycím sklíčkem položeným na dno misky. Po 24 hod jsou buňky přisedlé na krycí sklíčko. Sklíčka s buňkami opláchnout v PBS a inkubovat 5 minut v PBS s akridinovou oranží (5ug/ml – 1ul na 1ml PBS) a Hoechst33342 (5 ug/ml – 1ul na 1ml PBS). Sklíčka opláchnout PBS a umístit na podložní sklíčko do 2 ul PBS. Nechat oschnout a pozorovat pod flourescenčním mikroskopem. Úloha č.3 Fagocytóza Úvod: Jednou ze základních vlastností makrofágů je schopnost fagocytózy. V současné době existuje řada metod pro stanovení fagocytické aktivity makrofágů. Jedna z nich je založena na kultivaci buněk s Dynabeads M-270 Epoxy kuličkami o velikosti 2,8 mikrometrů (Dynal Biotechnologies). Makrofágové jsou schopni tyto kuličky fagocytovat a počet fagocytovaných kuliček jednotlivými buňkami lze vyhodnotit pod mikroskopem. Postup: 1. V 3x 5 ml média kultivujte vždy 1x10^6 buněk BM2 po dobu 24 hodin indukovaných a neindukovaných forbolovým esterem TPA spolu s 10 ul směsi Dynabeads M-270 Epoxy. 2. Buňky indukované TPA na jedné misce propláchněte EDTA/PBS a vyfotografujte pod mikroskopem. Vyhodnoťte počty fagocytovaných kuliček. 3. Zbytek misek skliďte, promyjte 1x v EDTA/PBS, resuspendujte v 1 ml 1x PBS. 4. Do zkumavky s 3 ml Histopaque přenést suspenzi buněk – nalévat po stěně, aby se vrstvy nepromíchaly 5. Cfg na centrifuze s výkyvným rotorem (Heraeus) 400g/15 min s pomalým rozběhem a bez brždění. 6. Buňky vytvoří bělavý prstenec. Vrstvu nad ním opatrně odsajeme, fázi s buňkami odebereme do nové zkumavky a promyjeme 10 ml 1x PBS. 7. Pelet resuspendujeme v malém množství PBS (podle jeho velikosti...přibližně v 10 ml) 8. 5 ml naneseme doprostřed skla, překryjeme krycím sklíčkem a přitlačíme 9. Vyhodnocujeme ještě týž den 200 buněk z každého skla Pozn: 1. Při sklízení dochází ke ztrátě buněk, proto kultivovat na 10 ml miskách 2. Poměr buňky:beads je 1:5, tj. 10 ml kuliček na 10 ml misku 3. Dodržovat stejně dlouhou dobu kultivace s beadsy, aby bylo možné srovnání Úloha č.4 NBT test Úvod: Proces fagocytózy je provázen sledem chemických reakci, v jejichž průběhu vznikají látky jako peroxid vodíku a kyselina chlorná, které slouží k usmrcení fagocytující buňkou pohlceného organismu. Tvorba těchto sloučenin je doprovázena vznikem kyslíkových radikálů, jejichž vznik můžeme prokázat pomocí tetrazoliové soli, která je radikály redukována na barevný formazán. Reakci vyhodnotíme spektrofotometricky. Buňky mohou být k tvorbě kyslíkových radikálů stimulovány jako odpověd na probíhající fagocytózu stejně jako forbolovým esterem PMA. Roztoky: 1. DMEM (bez séra), 37°C 2. 1mg/ml NBT v PBS s 2 ml/ml PMA (zásobní koncentrace 1 mg/ml, přidat těsně před použitím). 200ml na vzorek, připravit dopředu, před použitím zcentrifugovat naplno) Postup: 1. V 5 ml média kultivujte 1x10^6 buněk BM2 po dobu 72 hodin indukovaných a neindukovaných kombinací okadaické a retinové kyseliny. 2. 2x10^6 viabilních buněk z kultivační misky centrifugovat při 200g 3. Opatrně odsát supernatant 4. Sediment rozsuspendovat ve 400 ml DMEM bez séra, přidat 200 ml NBT v PBS/PMA (roztok 2) 5. Lehkým protřepáním rozsuspendovat buňky 6. Jednu hodinu inkubovat v termostatu (37°C) 7. Centrifugovat 10 minut 500 g, buňky suspendovat v 1 ml DMSO. 8. Centrifugovat 5 minut 500 g. 9. Supernatant po 200 ml přepipetovat na mikro-titrační destičku. 10. Změřit absorbanci na ELISA-readeru při 570 nm proti DMSO jako blanku. Úloha č.5 Stanovení transkripční aktivity receptorů pro kyselinu retinovou (RAR) v buňkách BM2 Úvod: Mezi významné regulátory genové exprese patří transkripční faktory (TF). Jejich hladina a aktivita musí v buňkách podléhat přísné regulaci. Obecně lze říct, že změna v úrovni exprese určitého TF nemusí automaticky znamenat změnu v jeho aktivitě. Ta může být ovlivněna celou řadou faktorů – post-translačními modifikacemi, vazbou aktivátoru či inhibitoru, lokalizací v buňce … Aktivita některých TF koreluje s jejich DNA vazebnou schopností a proto ji lze stanovit pomocí gel shift nebo gel supershift assaye. Jedním z možných způsobů stanovení aktivity libovolného TF je přechodná transfekce reportérového plazmidu a následné měřění aktivity reportérového genu v buněčných lyzátech. Reportérový plazmid: Plazmid obsahující reportérový gen (nejčastěji luciferáza) pod kontrolou promotoru, jehož aktivita je řízena specifickým TF. V našem případě budeme používat plazmid RAREβ2-TK-LUC, kde genu kódujícímu luciferázu je předřazen minimální promotor s vazebným místem pro RAR. Postup: A) TRANSFEKCE 1. Do mikrozkumavky napipetovat 200 ul média OPTI-MEM, přidat směs plazmidových DNA sestávající se z 1 ug RAREβ2-TK-LUC a 1 ug CMV-β-gal, přidat 4 ul XtremeGENE HP DNA transfection reagent (Sigma) a lehce promíchat. Inkubovat 20-30 minut při pokojové teplotě. 2. Přikapat tuto směs ke 4x10^6 buňkám BM2 ve 4 ml kompletního média. Inkubovat v CO[2] inkubátoru do druhého dne. 3. Druhý den buňky rozdělit na dvě 5ml misky, přidat 5 ul 10^-3M kyseliny retinové a inkubovat v CO[2] inkubátoru do druhého dne. 4. Buňky sklidit, opláchnout v PBS a resuspendovat ve 100 ul 0,25M Tris pH 7,5. B) Test na aktivitu β-galaktosidázy 1. Buněčnou suspenzi lyzovat 3 cykly opakovaného zamražování a rozmražování. 2. Po posledním rozmražení centrifugovat buněčný lyzát 5 minut při max. otáčkách v chlazené mikrocentrifuze. 3. Přenést supernatant buněčného lyzátu do nové mikrozkumavky a uchovat v -70°C nebo provést vlastní testy. 4. Pro každý testovaný vzorek na aktivitu β-galaktosidázy připravit následující směs: 100x roztok Mg 4 ml 1x ONPG 88 ml 0,1M fosfátový mix pH 7,5 268 ml 5. Směs rozpipetujte do zkumavek ke 40 ul buněčného lyzátu a inkubujte při 37°C se neobjeví žlutavé zbarvení. 6. Stanovte optickou densitu měřením při vlnové délce 420 nm. (rozsah linearity je 0,2-0,8 OD). Roztoky: 100x roztok Mg: 0,1M MgCl[2], 4,5M b-merkaptoetanol 1x ONPG: 4 mg/ml o-nitrofenyl-b-D-galaktopyranosidu v 0,1M fosfátovém mixu pH 7,5 0,1M fosfátový mix: 41 ml 0,2M Na[2]HPO[4 ]. 2H[2]O a 9 ml 0,2M NaH[2]PO[4 ]. 2H[2]O + 50 ml H[2]O. C) Test na aktivitu Luciferázy 1. 10 ml lyzátu přenést do 90 ml 0,25M Tris pH 7,5. 2. Přidat 360 ml luciferase assay buffer, přenést do luminometrické kyvety a promíchat na vortexu. 3. Přenést do komůrky luminometru, přidat 200 ml roztoku luciferinu (luciferin stock solution ředěný 5x H[2]O) a zaznamenat údaj o absolutní luciferázové aktivitě na luminometru. 4. Relativní luciferázovou aktivitu každého vzorku stanovit jako podíl absolutní luc. aktivity a b-gal aktivity na 1 ml extraktu. Zásobní roztoky: Luciferase assay buffer: Výsledný roztok Konc. zásobního roztoku Příprava 5ml pracovního roztoku 25mM Gly-Gly pH 7,8 250mM 0,5 ml 15mM KH[2]PO4, pH 7,8 0,1M 750 ml 15mM MgSO[4] 1M 75 ml 4mM EGTA 400mM 50 ml 2mM ATP 100mM 100 ml 1mM DTT 1M 5 ml ddH[2]O - 3 520 ml Luciferine stock solution: 1mM D-luciferin 25mM glycylglycine (Gly-Gly) 10mM DTT Alternativně lze rovněž analogicky stanovit aktivitu proteinu NFAT po působení ionomycinu s využitím reportérového plazmidu pro NFAT (ionomycin nechat působit přes noc). Úloha č.6 Stanovení Množství transkripčního faktoru NFAT v jádře buněk BM2 po působení ionomycinu Úvod: Kromě mikroskopických technik lze pro stanovení lokalizace určitého proteinu v buňkách použít i metody tzv. buněčné frakcionace. Tyto metody spočívají v separaci jednotlivých frakcí buněk na základě jejích specifických vlastností (velikost organel, jejich vznášivá hustota při ultracentrifugaci v gradientu, odolnost vůči působení detergentů nebo jiných specifických látek, působení hypotonických/hypertonických roztoků …). V dnešní době již existuje celá řada postupů pro oddělení cytoplazmy, jader, mitochondrií, lysozomů a dalších buněčných frakcí. Cíl: Cílem této úlohy je stanovení množství transkripčního faktoru NFAT1 v jádrech buněk BM2 ovlivněných/neovlivněných ionomycinem. NFAT1 je transkripční faktor, který je udržován v cytoplazmě buněk ve fosforylované formě. Po zvýšení cytoplasmatické koncentrace vápenatých iontů, dochází k aktivaci fosfatázy kalcineurin, která defosforyluje u proteinu NFAT1 serinové zbytky ve specifických sekvencích. Tato defosforylace vede následně ke konformační změně proteinu NFAT1 a k odhalení signálu pro translokaci do jádra. Defosforylovaný NFAT1 je následně translokován do buněčného jádra. Pro zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých iontů využijeme ionofor ionomycin (zvýšený transport vápenatých iontů do buněk). Postup: a) příprava buněk: 5x10^6 buněk MDA-MB-231 inkubovat v 5ml misce. Druhý den přidat k jedné misce 1 uM ionomycin + 1mM CaCl[2] a k druhé DMSO jako solvent. Po 30 minutach buňky sklidit pomocí roztoku Trypsin/EDTA, přenést do 15ml zkumavky, opláchnout vychlazeným roztokem PBS a provést frakcionaci jader pomocí kitu CelLytic NuCLEAR Extraction kit (Sigma Aldrich). b) frakcionace: K sedimentu buněk přidej 300 ul 1x lyzačního pufru (hypotonický pufr obsahující DTT a inhibitory proteáz a fosfatáz), resuspenduj buněčný pelet a inkubuj na ledu 15 minut. Přidej IGEPAL CA-630 detergent do výsledné koncentrace 0,6% (6 ul zásobního roztoku na 100 směsi). Vortexuj 10 vteřin. Centrifuguj 30 vteřin/11.000g/4^oC. Odeber cytoplasmatickou frakci. Resuspenduj pelet v 40 ul 2x CSB pufru a povař 5 minut při 100^oC. Změř koncentraci proteinů v obou vzorcích pomocí DC Protein Assay Kitu a provedˇelektroforézu proteinů a immunobloting se specifickou protilátkou proti proteinu NFAT1. Membránu následně obarvi nespecificky na proteiny roztokem amidové černi. Úloha č.7 Stanovení změn průběhu buněčného cyklu během diferenciace buněk bm2 vystavených tpa Úvod : Během diferenciace buněk dochází k zástavě buněčného cyklu. Tuto změnu lze sledovat analýzou obsahu DNA v buňkách po obarvení propidium jodidem pomocí průtokového cytometru FACSVerse. Propidium jodid je interkalující barvivo, které se váže k DNA a po ozáření světlem o vlnové délce 488 nm emituje záření (> 560 nm). Množství navázaného barviva je úměrné množství DNA v buňce. Z jednoparametrové analýzy fluorescenčního signálu propidium jodidu je možné určit obsah DNA v buňkách a tím i fázi buněčného cyklu, ve které se nacházejí. Cíl: Zjistit v jakým způsobem ovlivňuje TPA průchod buněk BM2 buněčným cyklem. Postup: 1. 2 5ml misky s 1x10^6 buněk BM2 inkubovat s forbolovým esterem TPA (7.5 ng/ml kultivačního media) v 24 hod. Zároveň kultivovat stejné množství BM2 buněk jako kontrolu. 2. Po 24 hod působení, odsát médium, sklidit buňky 1 mM EDTA v PBS, centrifugace 500g/5min 3. Buňky promýt 1xPBS 4. Pelet rozsuspendovat v 0,5 ml PBS a přikapat 4 ml vychlazeného 70% etanolu 5. Fixace min. 30 min v 4°C (lze i přes noc v lednici) 6. Centrifugace 200g/5 min, odsát supernatant 7. Promýt 4 ml 1xPBS 8. Rozsuspendovat v mikrozkumavce v 300-500 ul Vindelova roztoku (obsahuje propidium jodid a RNázu) – spojte oba vzorky s TPA do jednoho. 9. Barvit 30 min, 37°C, v temnu 10. Analýza množství DNA průtokovým cytometrem