Aquatic effect-based monitoring tools Luděk Sehnal  1. Úvod  Hydrologické problémy spojené s lidskou činností nebo přírodními změnami kvality vod  jsou  intenzivně  diskutovány  od  konce  60.  let  minulého  století.  Do  legislativy  se  první  standarty  pro  hodnocení  kvality  vody  dostali  v roce  1975  a  následně  v roce  1980  byly  nastaveny závazné cíle kvality pro pitnou vodu. V dnešní době je monitoring a hodnocení  kvality  vod  v evropské  unii  (EU)  řízen  prostřednictvím  rámcových  směrnic.    Z obecného  hlediska lze veškerá vodní tělesa plně charakterizovat pomocí 3 hlavním složek: hydrologie,  fyzikálně‐chemických  vlastností  a  biologie,  a  tak  kompletní  hodnocení  kvality  vody  je  založeno na vhodném monitoringu těchto 3 složek (Chapman et al., 1996).   Tato  seminární  práce  je  zamřena  na  využití  moderních  a  efektivních  metod  pro  monitoring  a  hodnocení  kvality  povrchových  vod,  přičemž  jsou  tyto  metody  založeny  na  detekci specifických efektů. Pojednává také o tom, jaký je v současnosti legislativní rámec EU  pro řízení monitoringu a hodnocení kvality vod a to jak vnitrozemských, tak mořských vod.  V neposlední  řadě,  práce  interpretuje  několik  případových  studií,  kde  bylo  využito  kombinace  chemických  analýz  a  souboru  biotestů,  biomarkerů  a  ekologických  indikátorů  chemického znečištění pro monitoring a hodnocení kvality vod.   2. Potenciál využití biotestů k monitoringu  Jde  o  techniky,  které  nacházejí  velké  využití  při  výzkumu  biologických  efektů  směsí  látek,  detekci  efektů  čistých  látek  a  také  pro  screeningové  testy  vzorků  z  prostředí,  a  to  zejména  pro  svou  specifickou  odpověď  na  působení  chemických  stressů.  V kontextu  WFD  jsou biotesty zmíněny v dokumentech Společné implantační Strategie (CIS). V pokynech CIS  je  uvedeno,  že  je  nutné  představit  další  techniky  pro  hodnocení  kvality  a  těžit  z vývoje  úsporných zdrojů, jakmile budou k dispozici. Lze tedy předpokládat, že by se tyto tzv. „effect  based  tools“,  jakožto  techniky  vhodné  pro  hodnocení  biologických  efektů,  mohli  stát  legislativní  součástí  WFD.  Současně  je  však  uvedeno,  že  jsou  designovány  k odpovědi  na  široké  spektrum  chemických  stresorů,  a  tudíž  nejsou  jednoznačně  propojitelné  s určitou  prioritní  látkou.  Z toho  vyplývá,  že  ačkoliv  jsou  velmi  užitečné,  nemohou  být  použity  jako  samostatné kontrolní jednotky v souladu s normami environmentální kvality (EQS). Nicméně,  potenciál těchto detekčních metod je značný, o čemž svědčí jejich vhodné využití pro:   Brzkou detekci biologické nerovnováhy   Propojení ekologické a chemické informace   Propojení koncentrací s expozicí a efekty    Včasné upozornění na změny kvality vody    Detekci a hodnocení významných polutantů pro aktualizaci hodnocení rizik   Detekci  nepříznivých  biologických  efektů  pro  zjištění,  kde  je  vyžadován  monitoring  Vhodnost  jakékoliv  konkrétní  metody  musí  být  hodnocena  s ohledem  na  její  cenu  a  praktickou  proveditelnost.  Metoda  musí  poskytnout  užitečné  informace,  které  následně  mohou napomoci cílům monitorovacích programů.  Z kontextu WFD je možné identifikovat několik cílů tzv. „effect based tools“ a několik z nich  je shrnuto zde:  a. Aby  plnili  funkci  screeningových  metod,  jako  součást  hodnocení  vlivů  a  dopadů na vodní ekosystémy  b. Aby plnili účel systému včasného varování, k prioritizaci studia dalších efektů  c. Aby zohlednili efekty směsí polutantů nebo neanalyzovaných látek   d. Aby dodatečně podpořili hodnocení kvality vod již zavedenými metodami  Dle typu monitorovacího přístupu lze tyto tzv. „effects based tools“ rozdělit do tří kategorií  na biomarkery, in vitro a in vivo biotesty. V následujícím textu této práce se podíváme jaké  výhody a nevýhody poskytují jednotlivé kategorie, z hlediska využitelnosti při monitoringu a  hodnocení rizik.  2.1.  Biotesty  Obecně jsou biotesty definovány jako testy, které měří toxicitu vzorků z prostředí při  laboratorních  podmínkách.  Využívají  přitom  běžných  postupů  k měření  toxikologických  endpointů na úrovní organismu nebo nižší (Piva et al., 2011). Důležitou součástí jak pro in  vitro, tak pro in vivo testy je správný odběr a zpracování vzorku, aby nedošlo ke změnám  chemického složení vzorků. Z toho důvodu vydala mezinárodní organizace pro standartizaci  (ISO) pokyny, jak správně provádět vzorkování vodních těles.   Většina vhodných přístupů je obecně založena na výběru adekvátní baterie testů a na  výběru  druhů,  které  by  měli  zohledňovat  různé  aspekty,  jako  jsou  citlivost,  specifičnost,  dostupnost organismu, variabilita metody, nákladnost, etičnost a standartizovatelnost ruku  v ruce  se  vzájemnou  kalibrací  metod.  S tím  pak  souvisí  validita  testů.  Mezinárodně  jsou  nejdůležitějšími  orgány  pro  vývoj,  validizaci  a  standardizaci  Organizace  pro  Spolupráci  a  Vývoj (OECD) a ISO, a to jak pro biotesty, tak analytické metody.   2.1.1. In vitro biotesty  In  vitro  biotesty  jsou  založeny  přednevším  na  testování  vzorků  z prostředí  na  laboratorních buněčných liniích s transfekovaným reportérovým genem. Test je založen na  specifické  odpovědi  transfekovaných  buněk,  jejichž  reportérový  gen  spouští  expresi detekovatelného produktu (luciferáza nebo GTP) v případě, že látka či skupina látek,  kterým  je  buněčná  linie  exponována  spouští  signalizační  dráhu  vazbou  na  specifický  receptor.  Typy  běžně  používaných  linií  jsou  uvedeny  v Tab  1.  Nejběžnější  linie  CALUX  je  komerčně dostupnou linií.  Název linie  Mechanismus působení   AR CALUX  Androgenní aktivita (AR)  DR CALUX  Vazba na aryl uhlovodíkový receptor (AH)  ER CALUX  Estrogení aktivita (ER)  GR CALUX  Glucokortikoidní aktivita (GR)  TRb CALUX  Tyroidní aktivita (TR)  YES  Estrogenní aktivita (ER)  Ames  Genotoxicita/mutagenita  ABC  Antibiotická aktivita  Tabulka 1 Přehled transfekovaných buněčných linií navržených pro monitorovací účely.  Prostřednictvím  in  vitro  biotestů  lze  sledovat  nepřeberné  množství  efektů  látek  v environmentálních směsích. Výhody těch testů (Tab. 2) jasně převažují nad nevýhodami,  avšak bez doplňující informace pokročilých analytických metod je jejich vypovídající hodnota  nedostačující.  A  tak  pouze  kombinace  těchto  metod  představuje  prospektivní  řešení  pro  monitoring a hodnocení kvality vod, což je ukázáno v  případové studii, viz příloha 1.   Výhody  Nevýhody  není třeba řešit etické problémy  nelze stanovit strukturu látek  velmi specifická odpověď  nízká vypovídající hodnota o   úrovních  lze testovat extrakty všech typu matric    je třeba malé množství vzorku    stačí krátký expoziční čas    nízké náklady    snadná identifikace toxických frakcí    dobře dostupné    Tabulka 2 Přehled výhod a nevýhod využití in vitro biotestů pro monitoring a hodnocení rizik.  2.1.2. In vivo biotesty  In  vivo  biotesty  slouží  k hodnocení  dopadů  chemických  látek  a  environmentálních  směsí  na  živé  organismy.  Většinou  jsou  testy  prováděny  v laboratoři,  v manipulovaných  podmínkách.  Výsledkem  takových  biotestů  jsou  tzv.  endpointy.  Jde  o  typy  efektů,  z nichž  jsou  některé  sledovány  již  při  expozici  a  některé  až  po  skončení  expozice.  Jako  příklady  takových efektů lze uvést mortalitu, vliv na reprodukci, metabolismus, fyziologické funkce či  chování. Je nutné testování na více trofických úrovních, protože druhová citlivost k různým  látkám je velice variabilní (viz příloha 3).  Obecně je in vivo biotestů široké spektrum a můžeme je dle délky expozice rozdělit na  akutní a chronické testy. U akutních testů nesmí, přesáhnou doba expozice 1 /3 průměrného  času od narození po sexuální zralost. Naopak, chronické efekty toxicity jsou měřeny až po  uplynutí doby delší, než je 50% celková doba života organismu. Velkou výhodou těchto testů  je možnost pozorování odpovědi živého organismu ke zvolené expozici. Avšak také velkou  nevýhodou  jejich  pracnost,  časová  náročnost  a  u  chronických  testů  i  finanční  náročnost.  Monitoring  environmentální  toxicity  v rozsahu  chronických  testů  je  tedy  z praktického  hlediska nemožný.   2.2.  Biomarkery   Tyto  metody  nachází  využití  při  studiu  takových  efektů,  jako  jsou  biochemické,  fyziologické či morfologické změny u exponovaných jedinců. Slouží ke studiu jedinců, kteří  jsou vystavení terénní expozici, ne při laboratorních podmínkách. Některé z biomarkerů jsou  již  zavedeny  v monitorovacích  programech,  aby  identifikovali  dopad  látek  a  směsí  látek,  které doposud nebyli prohlášeny jako nebezpečně a ke studiu trendů a včasné indikace o  snížené  environmentální  kvalitě.  Biomarkery  jsou  děleny  do  několika  kategorií.  Prvním  přístupem je dělení na specifické a obecné biomarkery:   Obecné – odpověď na několik skupin látek, často i na jiné stresory   Specifické – odpověď na specifickou skupinu látek (příloha 2)   Biomarker  Popis  Odpověď na typy látek  EROD  Biotransformační enzym  indukovaný planárními uhlovodíky  PCBs, PAHs a látky dioxinového  typu  AChE  Acetylcholinesteráza  Enzym, který se účastní přenosu  nervového vzruchu  Organofosfáty, karbamáty a  podobné molekuly  VTG  Vitellogenin  Prekurzor vaječného žloutku,  normálně syntetizován u samic ryb  Estrogenní endokrinně disruptivní  látky  MT  Metallotionein  Vazba kovů zapojená v ochraně  proti oxidativnímu stresu  Těžké kovy a induktory  oxidativního stresu  DNA dukty  Změny DNA struktury, které  mohou narušit funkci DNA  Genotoxické látky typů PAHs a jiné  organické polutanty  Imposex  Změna mužský pohlavních znaků  na ženské  TBT  Mikrojadérka  Poškození genetického materiálu  organismu  Látky způsobující permanentní a  dědičné DNA zlomy  Tabulka 3 Příklady některých biomarkerů používaných při monitoringu a hodnocení kvality  vod.  Druhý přístup je rozděluje na biomarkery expozice a efektu:   Expozice – měří změny na molekulární a buněčné úrovni, zahrnující indukci či  inhibici specifických enzymů   Efektu – měří odpovědi, které jsou relevantní ke zdraví organismu a možnosti  přežití a reprodukce, naznačující riziko na vyšší úrovni organizace  Při  studiu  efektů  určitých  typů  látek  je  nutná  kombinace  několika  odlišných  typů  biomarkerů, což může poskytnout velmi důležité informace, viz příloha 2. Broeg et al (2005)  uvádí,  že  multi‐biomarkerový  přístup,  založený  na  několika  různých  typech  biomarkerů  je  užitečným předpokladem pro hodnocení dopadů environmentální kontaminace na různých  úrovních organizace.   Obecně  lze  říct,  že  biomarkery  by  měli  být  spolehlivým,  relativně  levným,  snadno  proveditelným,  metodologicky  standardizovaným  hodnotícím  kriteriem.  Navíc,  použití  neinvazivních  a  nedestruktivních  metod  by  mohlo  usnadnit  určité  typy  aplikací.  Využití  biomarkerů se teda zdá jako vhodný a efektivní přístup pro monitoring a hodnocení kvality,  který je již dobře vědecky popsán a současně již zahrnut při hodnocení kvality.   2.3. Ekologické indikátory chemického znečištění  V souvislosti s WFD jsou populace a celá společenstva vhodným biologickým stupněm  organizace, na kterém by měli být efekty látek přítomných v prostředí hodnoceny. Tudíž jsou  vyžadovány  metody,  které  jsou  využitelné  pro  přímý  monitoring  efektů  stresu  na  úrovni  celých  společenstev  a  tudíž  vhodné  pro  hodnocení  ekologického  stavu.  Několik  takových  technik bude popsáno v následujícím textu.  Moderní  metody  pro  hodnocení  ekologického  stavu  se  vztahují  na  strukturu  (tedy  druhové  složení  a  hojnost)  a  funkčnost  (tedy  druhové  znaky)  společenstev.  Tyto  techniky  využívají multimetrických indexů založených na bio‐ekologických znacích.   2.3.1 SPEAR index  Jde o bioindikační systém, založený na biologických znacích, který je vysoce citlivý k určitým  skupinám polutantů a relativně nezávislý na vedlejších faktorech (Beketov and Liess, 2008  and Liess et al., 2008). Index měří poměr mezi citlivými a méně citlivými druhy.  SPEAR index= (citlivé/necitlivé)*100  Z indexu vyplývá, že čím vyšší je jeho hodnota, tím méně je oblast ovlivněna sledovaným  stresem.  V současnosti  zahrnuje  index  dva  typy  indikátorů  podle  typů  sledovaných  kontaminantů,  a  to  pesticidy  a  organické  polutanty.  Tento  index  byl  již  aplikován  pro  výzkumné účely nebo při hodnocení rizik, zatím však ne pro běžný monitoring. V EU však  nachází široké uplatnění a lze předpokládat, že bude zahrnut i do monitoringu.   2.3.2 Tolerance společenstva indukovaná znečištěním (PICT)  Tato citlivá metoda sleduje změny ve funkčnosti komunity (tudíž současně indikuje i  změny strukturní), které mohou být připisovány toxickým látkám. Není to index, ale spíše  metoda  pro  vysvětlení,  proč  musí  komunita  změnit  složení,  když  je  vystavena  určitému  stresu.  Přístup  spoléhá  na  to,  že  citlivé  složky  společenstva  budou  přesunuty  více  tolerantnějšími  zástupci,  a  tak  povedou  ke  zvýšení  citlivosti  celého  společenstva.  Měří  funkční  test,  který  detekuje  následky  selekčního  tlaku.  Například  pomocí  krátkého  testu  toxicity  založeného  na  ekofyziologickém  endpointu.  Tento  přístup  je  shrnut  také  v práci  Blanck & Wängberg (1988), autorů kteří stojí za vznikem této metody.  PICT  byl  již  dříve  využíván  k hodnocení  vývoje  tolerance  některých  modelových  organismů, například bakterií. Byl také využit při hodnocení rizik jednotlivých kontaminantů  na ůrovni společenstva. PICT je stále vyvíjen a v kombinaci s novými metodami, by mohl být  užitečný v kontextu WFD.  3. Rámcové směrnice pro vody – WFD & MSFD  V současné  době  se  evropská  vodní  politika  řídí  dle  rámcových  směrnic.  Rámcové  směrnice  jsou  dvě,  přičemž  rámcová  směrnice  vod  (WFD)  je  regulační  orgán  pro  vody  vnitrozemské (platnost od roku 2000) a rámcová strategická směrnice pro moře (MSFD) je  regulační orgán pro vody mořské (platnost od roku 2008). Obecně rámcové směrnice vod  představují  operační  nástroj  a  nastavení  cílů  pro  ochranu  vod  s výhledem  do  budoucna.  Směrnice vyžadují sjednocený přístup k monitoringu a hodnocení kvality vod. Při hodnocení  ekologického  stavu  se  zohledňují  efekty  na  úrovni  populace  či  celých  společenstev,  kdy  základem  je  využití  specifických  indikátorů  a  ekologických  poměrů  kvality.  Hodnocení  chemického  stavu  vody  je  založeno  na  souladu  s  právně  závaznými  standarty  kvality  životního prostředí pro vybrané chemické polutanty v rámci celé EU.  4. Závěr  Neustálé zlepšování metod pro monitoring a hodnocení kvality vod je velmi důležité  z hlediska ochrany životního prostředí. Přesné informace o ekologickém i chemickém stavu  vod  vedou  k výraznému  zlepšování  kvality  vod  a  díky  metodám  včasné  detekce  hrozícího  nebezpečí,  lze  předcházet  rozsáhlejším  problémům  způsobených  kvalitou  vody.  V EU  je  monitoring a hodnocení kvality řízen pomocí WFD a spolupracujících organizací, například  OECD.  Hlavními zdroji pro tuto seminární práci byly Wernersson et al (2014) a Chapman et al  (1996), které jsou spolu s ostatními zdroji uvedeny v seznamu literatury.               Seznam literatury:  Beketov,  M.  A.,  &  Liess,  M.  (2008).  An  indicator  for  effects  of  organic  toxicants  on  lotic  invertebrate  communities:  independence  of  confounding  environmental  factors  over  an  extensive  river  continuum. Environmental Pollution, 156(3), 980‐987.    Blanck, H., & Wängberg, S. Å. (1988). Induced community tolerance in marine periphyton established under  arsenate stress. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 45(10), 1816‐1819.    Broeg, K., Westernhagen, H. V., Zander, S., Körting, W., & Köhler, A. (2005). The “bioeffect assessment  index”(BAI): A concept for the quantification of effects of marine pollution by an integrated biomarker  approach. Marine Pollution Bulletin, 50(5), 495‐503.    Chapman, D. V. (Ed.). (1996). Water quality assessments: a guide to the use of biota, sediments and water in  environmental monitoring.  Liess, M., Schäfer, R. B., & Schriever, C. A. (2008). The footprint of pesticide stress in communities—species  traits reveal community effects of toxicants.Science of the total environment, 406(3), 484‐490.  Piva, F., Ciaprini, F., Onorati, F., Benedetti, M., Fattorini, D., Ausili, A., & Regoli, F. (2011). Assessing sediment  hazard through a weight of evidence approach with bioindicator organisms: a practical model to elaborate data  from sediment chemistry, bioavailability, biomarkers and ecotoxicological bioassays.Chemosphere, 83(4), 475‐ 485.  Wernersson, A. S., Maggi, C., & Carere, M. (2014). Technical report on aquatic effect‐based monitoring  tools. European Commission.                                                      PŘÍLOHA 1                                                                                                          adsf                                                                                                                                                                                                                                                                                              PŘÍLOHA 2                                                                                                                                                                                                    PŘÍLOHA 3                                                                                                                                                                                                                                                            PŘÍLOHA 4