Tkáňové kultury E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223 / 116 Tkáňové kultury (= TK, Tissue culture - TC) – růst živočišných buněk a tkání in vitro 1885 – ROUX, kuřecí embryonální buňky v solném roztoku 1940 – EARLE, první kontinuálně kultivovaná linie, buňky myší pojivové ---------tkáně, jejím subklonem je dnešní linie L929 Provozování tkáňových kultur spočívá v zajištění optimálních podmínek pro růst a přežívání kultivovaných buněk / tkání! (Pro jednoduchost se dále budou uvažovat jen buňky, problematika tkání a orgánů bude stručně zmíněna na závěr.) FYZIKÁLNÍ, CHEMICKÉ a BIOLOGICKÉ faktory, které je třeba regulovat za běžných laboratorních podmínek. TEPLOTA Buňky se kultivují při optimální teplotě pro organismus, z kterého byly izolovány. Pro buněčné linie odvozené od člověka a běžných laboratorních zvířat (myš, krysa, makak, pes,..) je to většinou 37oC. Pro buněčné linie odvozené od poikilotermních živočichů (ryby, hmyz, háďátko - Caenorhabditis) od 10 do 25oC. Různé druhy záření, tlak, různá pole,… - dodržet podmínky na které jsou buňky zvyklé/přizpůsobené Teplota modifikuje biochemické děje - s vyšší teplotou se urychlují chemické reakce - v závislosti na teplotě se mění i afinita substrátu k enzymům – Km (Michaelis-Menten koeficinet) Změna velikosti Km pro acetylcholin k acetylcholinesterázu (AChE) P – hlaváč, Rt – pstruh duhový, M – cípal, L -Elops Závislost Km na teplotě pro pyruvát a LDH u různých obratlovců Bt – tuňák obecný, R – králík, Ray – rejnok, M – hlaváč (Gobii) Pagothenia borchgrevink Elops Některé organismy mají tak více enzymových isoforem pro stejnou reakci pro Snadnější regulaci homeostáze za různých teplot! Na CHEMICKÉ faktory lze nahlížet jako na média (jejich komponenty) v kterých buňky rostou a plyny, které tato média obklopují případně jsou v nich rozpuštěny. Složení médií Veškeré komponenty použité pro přípravu médií musí být vysoké kvality, s minimem nežádoucích příměsí (minimální chemická čistota p.a. – pro analýzu) Základem je voda a v ní rozpuštěné anorganické soli. Soli jsou zdrojem nezbytných iontů, a hrají významnou úlohu v zajištění vhodného pH (optimium většinou 7.2-7.4) a osmotického tlaku / Osmomolarita (optimum většinou 280- 320 mOsmol/L). Nejzákladnější ionty obsažené v médiích jsou: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, HCO3 -. Osmotický tlak je roven koncentracím rozpuštěných iontů/molekul 1 M NaCl = 1 Osm/L Na+ + 1 Osm/L Cl- = 2 Osm/L 1 M CaCl2 = 1 Osm/L Ca2+ + 2 Osmol/L Cl- = 3 Osm/L 1 M glukósy = 1 Osm/L Esenciální látky pro růst buněk Média musí také obsahovat sacharidy (většinou glukózu, jako zdroj energie), aminokyseliny (esenciální i neesenciální), vitaminy a stopové prvky. Většina zejména savčích buněk vyžaduje Insulin (příjem glukózy) Transferin (příjem železa) Selen (nezbytný pro funkci oxidačně-redukčních enzymů) – také tzv. minimální přídavek do médií Další doplňky Lipidy (mastné kyseliny), steroidní látky, hormony, cytokiny, peptidy, proteiny extracelulární matrix, proteiny séra, nukleosidy,… Mnohé z těchto látek jsou suplovány přídavkem séra (5 - 10 - 20%), v některých případech i jinými zdroji málo charakterizovaných směsí proteinů a dalších látek. Významnými doplňky jsou ochranné látky jako 2-b-merkaptoetanol (snižuje oxidativní stres a může sloužit i jako zdroj síry) a antibiotika (ochrana proti mikroorganismům případně selekční agens) Základní média v tkáňových kulturách Základem jsou tzv. Earliho soli: chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, síran horečnatý, dihydrogenfosfát sodný BME with EBSS – základní (basal) médium s Earliho solemi Alfa MEM – alfa modifikované Eaglovo médium DMEM – Dulbekovo MEM, běžné pro adherentní buněčné linie RPMI 1640 – zejména buňky hematopoetického původu IMDM – Iscovovo modifikované Dulbeccovo médium, vhodné pro rychle rostoucí buňky (v základu neobsahuje Fe ionty) Hamovo F12 – médium bohaté živinami, často v kombinaci 1:1 s DMEM jako základ pro kultury bez séra DMEM – high glucose Sérum - nejčastěji bovinní fetální*, ale i jiné zdroje - lidské, koňské, kozí, myší,... - embryonálí (fetální), novorozenecká, dospělá *fetální => nízká hladina nízkoafinitních imunoglobulinů (protilátek) - různé stupně kvality - testy na přítomnost endotoxinů - testy na snášenlivost konkrétním typem buněk - testy na přítomnost virů - ..... - různé země původu (USA, Austrálie,...) - různé šarže (lot number) normální x inaktivní sérum - inaktivace séra = 30 (45) minut při 56 °C => inaktivace komplementu atd... Při přípravě médií je pH nastaveno/doladěno HCl (1M) a NaOH (1M). pH v kultuře se mění v důsledku metabolismu buněk, zejména produkcí laktátu a CO2 V průběhu kultivace je udržováno: 1) Přítomnými ionty, zejména fosfátovými (z fosforečnanů) 2) Proteiny s pufračními schopnostmi 3) Systémem H2CO3 / CO2 4) Alternativně silně pufrujícími látkami jako je HEPES, BES, TES K orientační detekci pH média v kultuře slouží fenolová červeň přidávaná do médií. pH < 6 7 < 8 pH Pufrační systém H2CO3 / CO2 (NaHCO3) CO2 + H2O = H2CO3 = H+ + HCO3 Kultivace : otevřená – s výměnou plynů (zejména přísun CO2 z vnějšku) uzavřená – bez výměny plynů (používá se ~ ½ množství NaHCO3) - Při otevřeném systému kultivace se nejčastěji udržuje atmosféra s navýšeným obsahem CO2, standardně 5% CO2 (regulovaný přísun ze zásobní bomby) a 95% vody (regulovaný přísun, nebo častěji spontánním odparem ze zásobníku. http://www2.biomed.cas.cz/d331/vade/ph.html V některých speciálních případech je vhodné použít polotekutá až pevná média Takové médium se připraví přídavkem: - Agaru (je třeba dávat pozor na přehřátí složek média během přípravy, teplota by neměla být vyšší jak 40oC) - Metylcelulósy - Fibrinogenu (po aktivaci -> fibrin / fibrinová síť) - je možné použít i čistě syntetické polymery, např. metakryláty (hydrogely) Trvanlivost a uchování médií a jejich doplňků !doporučení výrobce – dodavatele! - Solné roztoky jsou stabilní i při R.T. (room temperature ~ 20oC) - Většina složek média (aminokyseliny, vitaminy, sacharidy,..) je stabilní po dobu jednoho roku při 4oC a tmě - Glutamin v roztoku se nejpozději po 3 měsících začne rozkládat = je třeba ho přidávat samostatně ze zamražéné zásoby. Jeden rok při 4oC se ale ješte považuje za akceptovatelný, možno nahradit médii s Glutamax a pod. - Sérum při 4oC až 2 měsíce, při -20oC až 3 roky - Obecně při teplotách pod -70oC je vše stabilní minimálně 1 rok - Stabilita je závislá na tekutosti / zmrzlosti roztoku, což je ovlivněno složením a koncentrací rozpuštěných komponent. Např. soli a glycerol posouvá bod tuhnutí k nižším teplotám (při -20oC není 10% roztok glycerolu úplně zmrzlý) a DMSO k vyšším teplotám (tuhne už při ~ +6oC) - Jiné buněčné linie (zkreslení výsledků buněčnou specializací, dominance invazní buněčné linie = zánik původní buněčné linie) - Plísně, kvasinky, bakterie (toxiny, vyčerpání média = zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora) - Viry (zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora) Biologické faktory – v kultuře roste ještě něco navíc než požadujeme = čistota kultury / sterilita 1. PREVENCE + MONITORING! 2. LÉČENÍ PROVOZ - Laboratoř TC (LTC) je pokud možno oddělená od ostatních prostor, nevětrá se přímo okny, ale pokud možno přes ventilační systém s filtrací - Pravidelně se provádí úklid a desinfekce povrchů (prostředky na bázi chloru – SAVO, Jodu – Ajatin, 70% EtOH,….) - LTC je periodicky vysvěcována germicidní (širokospektré UV) lampou - Pracovníci LTC používají pracovní oblečení určené jen pro LTC a před vlastní prací si desinfikují ruce příslušnými prostředky (minimálně použití 70% EtOH) - S kulturami se pracuje pokud možnou pouze ve Flow-boxu PREVENCE MATERIÁL Čisté materiály se podle své odolnosti / vlastností sterilizují-desinfikují: (čistý z čistých surovin nebo po důkladném omytí speciálními detergenty) autoklávováním (120oC, 20-30 minut) – solné roztoky, některé pufry, agar, želatina/kolagen, některý plastik,.. suchým teplem (180oC, 3 až 4h) – sklo, vzácně některý plastik (do 120oC) zářením gama (vzácně i UV – jen povrchy) – plastik, sklo filtrováním - vzduch (HEPA filtry s póry 0,3 mm), roztoky hlavně média a séra běžně přes filtry s póry 0,2 mm) omytím (2-5% aldehydy, 70% EtOH, 2-5% fenol, 5-10% peroxid vodíku,….) – nástroje, pracovní plochy, některý plastik, sklo (celkově může být málo účinné a požkozující čištěný materiál) plamenem -kovy, sklo parami alkylačních činidel - někdy kombinace s autoklávováním (etylén oxid), speciální aplikace jako dekontaminace filtrů flow-boxů, dekontaminace místností (formaldehyd), vždy problém pro obsluhu! Významným prevenčním agens v médiích jsou antibiotika. Kritéria pro antibiotika: - nesmí inhibovat růst a ani ovlivňovat metabolismus buněk - musí ochraňovat kulturu po celou dobu experimentu - netoxické a bezpečné pro uživatele - kompatibilní s ostatními složkami média - rozpustné v netoxických rozpouštědlech a) Ochranné proti mikroorganismům Nejčastěji penicilin/streptomycin nebo gentamycin, příležitostně tetracyklin b) Selekční (viz. Příprava transgenních linií) Geneticin (G418), Hygromycin, Puromycin c) Speciální Mitomycin C Přehled nejčastěji používaných antibiotik G+ ... grampozitivní bakterie G- ... gramnegativní bakterie IP ... inhibuje proteosyntézu ISBS ... inhibuje syntézu bakteriální stěny MONITORING - V kultuře nebo v zásobních roztocích něco roste co tam nemá být (plísně = chomáčky; kvasinky = pučící buňky, řetízky; bakterie = drobné útvary, kulovité až vláknité, někdy řetízky) - Dochází k rychlému vyčerpání média (rychle mění barvu z červené na žlutou = pokles pH) - Buňky špatně rostou, nemají správný tvar, adherentní se pouští podkladu - Mikroskopické barvení na celkovou DNA (zviditelnění mikroorganismů, zejména endoparaziti) - Stanovení specifických antigenů (Imunocytochemie, western blot) - Detekce specifických sekvencí pro jednotlivé organismy PCR metodou - Kontrolní kultivací médií samotných nebo po přídavku specifických substrátů - Výsledky experimentů nejsou reprodukovatelné / jsou chaotické - Buňky jsou citlivější ke stresu LÉČENÍ - Likvidace zasažené kultury - Kombinací antibiotik - Kultivací buněk v kompatibilním organismu (např. v břišní dutině = ascites) ? Chomáček plísně v kultuře 1 mm Kvasinky + Buňky (HL-60) 50 mm - Běžným VIS mikroskopem prakticky nejsou vidět - Intracelulární bezestěné bakterie (trojvrstevná cytoplasmatická membrána) DETEKCE (je třeba kukltivovat bez antibiotik – možné přežívání na pozadí): - Vitální barvení na DNA (Hoechst) - Detekce specifických DNA sekvencí pomocí PCR - In situ hybridizace (RNA , DNA) - Měření enzymatické aktivity, systémy s transgenními buňkami (fy. Invivogene,…) - (Inkorporace uracilu (mycoplasmata) X uridinu (eukaryontní buňky)) ZDROJE: - infikované buňky v TC! - práce se zvířaty v laboratoři TC - pracovníci laboratoře TC LÉČENÍ: - Kombinací antibiotik - Pasážováním buněk v kompatibilním organismu (ascites – volně v břišní dutině) Mycoplasmata Viabilita některých druhů mycoplasmat za různých podmínek Obecné schéma léčení buněčných linií v LTK na mycoplasmata Příklad postupu léčení buněčné kultury na mycoplasmata přípravkem BM-cyclin fy Roche Účinnost komerčně dostupných antibiotik v léčení kultur napadených mycolpasmaty Uphoff & Drexler 2001 n – počet testovaných buněčných linií MycoAlert® Mycoplasma Detection Kit MycoZap™ Mycoplasma Elimination Reagent Zdravá buněčná kultura Buněčná kultura infikovaná mycoplasmaty (vitální barvení pomocí Hoechst 33258) Základní vybavení laboratoře tkáňových kultur Inverzní mikroskop CO2 inkubátor Flow-box / laminární box - základní Flow-box / laminární box – biohazard, Počítač částic Průtokový cytometr / Flow-cytometer (FACS) - Inkubátor / termostat s regulací teploty a složení atmosféry - Flow-box = laminární box - Inverzní mikroskop, nejlépe s fázovým kontrastem (Nomarského – vnitřní struktura buněk; Hoffmanův (reliéfní) – plastické znázornění povrchů) - Počítač částic (hemocytometr, Bürkrova komůrka, Coulter Counter, FACS,..) - Lednice a mrazáky - Kontejner s tekutým N2 (-196oC), nebo extrémně hluboko-mrazící box (-150oC a méně) - Autokláv (parní sterilizátor), horkovzdušný sterilizátor - Centrifuga - Pipetor / Pipetus (manuální nebo elektronický) - Automatické pipety - Technické zázemí – umývárna, sklad, šatna,… Podle způsobu kultivace - Adherentní (většina, rostou přichyceny k podkladu) - Suspenzní (zejména buňky krve a jejich deriváty, volně se vznášejí v médiu) BUŇKY V TC Adherentní – (linie HaCaT) Suspenzní – (linie HL60) 100 mm PROLIFERACE x DIFERENCIACE x APOPTÓZA Buňky a jejich vlastnosti (v TC). PROLIFERACE = dělení buněk DIFERENCIACE = rozrůzňování buněk Apoptósa (+ nekrósa) – smrt buňky x viabilita buněk Podle původu a vlastností - Primokultury Buňky izolované většinou ze zdravé tkáně (obecně zdravý genom, ale většinou omezené možnosti kultivace/dělení buněk) - Permanentní linie Nejčastěji buňky izolované z nádorů, ale mohu být i ze zdravé tkáně, případně ze zdravé tkáně a imortalizované (většina chyby v genomu -> nestabilita, jsou ale nesmrtelné), adaptace na podmínky in vitro!!! PRIMOKULTURY PERMANENTNÍ LINIE heterogení klon omezená životnost (H.l.) nesmrtelné Většinou náročnější na kultivaci Obecně snadno kultivovatelné variabilita izolací genetická nestabilita BUŇKY NORMÁLNÍ IMORTALIZOVANÉ NÁDOROVÉ diploidní diploidní / aneuploidní diploidní / aneuploidní /polyploidní senescence / Hayflick limit nesmrtelnost nesmrtelnost Růst závislý na kontaktu s podložkou (anchorage-dependent) Růst závislý na kontaktu s podložkou (anchorage-dependent) Růst je nezávislý na kontaktu s posdložkou (anchorage-independent) +++/- specifické růstové faktory +/- specifické růstové faktory +/--- specifické růstové faktory netvoří nádory netvoří nádory tvoří nádory A) Buňky se v kultuře nedělí – je třeba periodicky měnit kultivační médium (terminálně diferencované, postmitotické buňky, často u primokultur) B) Buňky se v kultuře dělí = proliferují – je třeba je pasážovat (ředit a měnit médium, většina buněk primokultur i permanentních linií) Pasážování – periodické „ředění buněk“, obecně spojené i s výměnou média RŮST BUNĚK V TC Adherentní linie* – mechanicky nebo enzymatickým štěpením vazeb buňky / substrát; buňka / buňka Enzymy - trypsin, colagenáza,..; inaktivace spec. inhibitory, vyředěním, nadbytkem proteinů (např. sérem) Podpůrné látky – EDTA (zejména vychytávání Ca2+) Suspenzní linie – prostým ředěním * Ve většině případů je u adherentních linií nutno počítat s jejich zvýšenými nároky na kvalitu podkladu, na kterém rostou. Běžně se používá ošetření 0.01 – 0.1 % roztokem želatiny (prasečí, hovězí) v dH2O. Podle potřeby a typu buněk se používají ale i ostatní proteiny ECM. Pasážování buněk pomocí tzv. trypsinizace (enzymatické rozvolnění) konfluentní buňky (100%) rozvolněné konfluentní buňky nová pasáž (konfluence ~20%) enzymaticky rozvolněné buňky (suspenze) část buněk na novou misku, do nového média rozvolnění buněk deplecí Ca2+ iontů (chelatony např. EDTA) enzymaticke štepení např. trypsinemrůst kultury Dále je buněčná proliferace charakterizována: Buněčná - denzita – počet buněk na ml nebo cm2 - konfluence – počet buněk na plochu u adherentních linií (b. / cm2, častěji „%“ plochy) Generační dobou - doba mezi dvěma mitózami / rozděleními buňky = délka buněčného cyklu Doubling time – čas potřebný ke zdvojnásobení buněk v populaci Hayflickův limit – v případě většiny primokultur počet možných dělení, buněčně specifické (senescence – stárnutí buněk, „quiescence – klid/spánek buněk“) Proliferaci buněk v kultuře charakterizuje růstová křivka s 3 fázemi Početbuněk Čas Lag fáze Logaritmická (růstová) fáze Stacionární fáze Analýza buněčné proliferace Počítáním buněk - v mikroskopu (Bürkrova komůrka / hemocytometr) - přístroji (Coulter counter – počítač částic, FACS – , průtokový cytometr, u většiny přístrojů potřeba vnitřního standardu) Přírůstek v množství DNA (lze použít i pro jednotlivou buňku) - Inkorporace 3H thymidinu (měří se přírůstek radioaktivity, celkový, nebo u jednotlivé buňky) - Inkorporace BrdU (bromdeoxyuridinu, analog thymidinu), množství BrdU se stanoví pomocí protilátky (lze na populaci i jednotlivé buňce) - Celkové množství DNA v buňce -> stanovení fáze buněčného cyklu Průtokový cytometr (Flow-cytometr / FACS) Přírůstek celkových proteinů - nepoužitelné u buněk produkujících velké množství extracelulární matrix (ECM) Stanovení enzymatické aktivity (enzymy permanentních metabolických drah) - testy využívající tetrazoliové soli (např. MTT, WST-1), které jsou redukovány na barevné formazany, které se dají stanovit spektrofotometricky (různé tetrazoliové soli jsou různě citlivé pro jednotlivé enzymatické (oxidačně redukční, NADP) systémy a i vhodné pro různé typy buněk) Stanovení exprese specifických proteinů spřažených s proliferací - imunohistochemicky (jednotlivé buňky) - western blotem (celkově v populaci) (PCNA, Ki-67, cykliny, inhibitory na cyklinech závislých kináz (cyklin-dependentní kinázy),.. Nedílnou součástí sledování proliferační aktivity buněk je i detekce jejich životaschopnosti = viability, která je spojená s buněčnou smrtí = apoptózou, případně s nekrózou Analýza viability a apoptózy A) Testy založeny na kompaktnosti zdravé buňky a jejím „správném“ chování / funkci - Morfologické změny (apoptická tělíska, výběžky, …) - Schopnost vylučovat barviva živými buňkami (eosin, bromfenolovou modř pro detekci ve VIS, propidium iodid pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS) - Enzymatická aktivita, nejčasteji esterázy (fluorescein diacetát pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS, možno kombinovat s propidium iodidem) - U adherentních buněk lze hodnotit počet adherovaných a plovoucích (mrtvých / apoptických buněk - Změny ve struktuře cytoplasmatické membrány -> anexin / fosfatidylseriny Annexin assay B) Testy založeny na stanovení biochemických a molekulárně biologických parametrů - Fragmentace DNA (elektroforeticky = tzv. apop. žebříček DNA, in situ = TUNEL assay, Comet assay) - Aktivita specifických proteáz = kaspásy, detekce fragmentace substrátů kaspás - Hladiny pro- a anti-apoptických proteinů rodiny Bcl-2 - Kompaktnost mitochondrií (změny v polarizaci m. membrány, vylití cytochromu c) TUNEL assay, red – nuclei, green apoptosis TUNEL – Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling Comet assay Eosin (Trypan blue) stain of viability Diferenciace buněk V průběhu kultivace (pasážování) buněk se volbou vhodných podmínek snažíme, aby si buňky dlouhodobě zachovali stabilní genotyp i fenotym. Přitom u nádorových línií je udržení stabilního genotypu už z principu problematické. Změny kultivačních podmínek mohou vést k nestabilitě již tak obecně nestabilního geneotypu u nádorových linií, ale vedou zejména ke změně fenotypu => diferenciaci, a to jak cílené tak náhodné. DIFERENCIACE JE PRAKTICKY VŽDY SPOJENA I SE ZMĚNOU PROLIFERAČNÍCH PARAMETRŮ, PŘÍPADNĚ I S APOPTÓZOU. Parametry analýzy diferenciace: - změny v morfologii buněk - změny v expresi genů: detekce specifických mRNA a specifických proteinů (v časných stádiích zejména transkripční faktory, později zejména strukturní proteiny a enzymy) - funkční testy (fagocyty – fagocytóza; nervy – přenos signálu, depolarizace membrány, produkce mediátorů; svaly – odpověď na stimulus, kontrakce; epitely - produkce mucinů;…..; transplantace a sledování jak se transplantované buňky zapojí do funkce dané tkáně) Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk 6 days RT-PCR analýza exprese liniově specifických genů  neuroektoderm  entoderm Nediferencované buňky EC Diferencované buňky EC monovrstva + RA - sérum Diferencovane buňky EC monovrstva + RA + sérum  buněčná jádra  cytokeratin EndoA pozitivní buňky – entoderm  N-CAM pozitivní buňky - neurony Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci EC buněk Zdroje buněk v TC C) Příprava primokultur z živočišných tkání B) Příprava kmenů (populace) nebo klonů (z jednotlivé buňky) z nádorů Izolace nádoru, jeho enzymatická disociace na buněčnou suspenzi, kultivace buněk ve vhodných podmínkách, selekce zajímavých kmenů, klonů a jejich charakterizace v průběhu kultivace -> linie musí vykazovat dostatečnou stabilitu v průběhu kultivace, aby byla zachována reprodukovatelnost výsledků. Popis nově získané linie by měl obsahovat co nejvíce její chrakteristik. Původ (typ nádoru, věk a pohlaví dárce, způsob získání, počet pasáží od jejího ustanovení, charakterizace fenotypu i genotypu,..) A) Tkáňová banka nebo darem např. American Tissue Culture Colection (www.atcc.com) Příprava myších embryonálních fibroblastů MEF – mouse embryonic fibroblast PEF – primordial embryonic fibroblast - Připravují se nejčastěji z 13.5 denních embryí (11-13.5 dpc.) - Gravidní samice se usmrtí a vypreparuje se děloha s embryi - Z embryí se odstraní hlava a vnitřní orgány - Zbytek embrya se enzymaticky a mechanicky rozruší a po odstranění kompaktních zbytků, se suspenze vyseje na kultivační misku - Rozrostlé buňky se zamrazí (pasáž 0) a nebo se dále kultivují (~6-15 pasáží ~ 24-60 dnů, Hayflick limit) Příprava stromálních buněk kostní dřeně BMSC – bone marow stromal cells - Vypreparujeme stehenní kost, odstřihneme hlavice a propláchneme (např. injekční stříkačkou) vhodným kultivačním médiem do kutivační misky (lze i kost navrtat a odsát (např. injekční stříkačkou) = možné autotransplantace). - Po 24 hodinách kultivace odstraníme médium se zbylými krevními elementy opláchneme a přidáme nové médium. - Stromální buňky postupně vytváří nepravidelné kolonie fibroblastům podobných buněk - Standardně je lze kultivovat minimálně 2-3 týdny Pozn. potkaní a lidské rostou lépe jak myší 3,5 dní p.c. ICM Linie ES buněk na feederu MEF 4-5 dní Fibroblastová výživná vrstva „feeder“- tvořená MEF TE Odstranění PEF Homogenní populace ES buněk Vyseknutí a disociace ICM Příprava myších ES buněk ES – embryonic stem, embryonální kmenové Upraveno podle Kroupová 2004 Dlouhodobé uchování buněčných linií v TC Permanentní kultivace - selekce buněk s odlišnými vlastnostmi než měly ty původní - časově a finančně náročné • Empiricky je za stabilní považováno 10 – 30 pasáží v závislosti na buněčné linii a i na kultivačních podmínkách. • Nádorové linie jsou obecně méně stabilní (poškozený genotyp) než primokultury (zde ale nevýhoda Hayflickova limitu). • Výjimkou se v současné době zdají být myší ES buňky, u kterých jsou známy kultivační podmínky, kdy dlouhodobě (> 100 pasáží) v zásadě nemění své vlastnosti. Zamražování buněk Obecně v kultivačním médiu a) se zvýšeným obsahem séra (20-100%) b) se sérem (10-20-50%) s přídavkem DMSO (5-10%) c) vzácně se sérem (10-20-50%) a přídavkem glycerolu (10%) Buňky je třeba zchlazovat postupně na ~ -80oC, poté se přenesou do ultra-hlubokomrazícího boxu (~ -185oC) nebo do tekutého N2 (-196oC) k trvalému uchování. Je vhodné pro zamražení používat vysoké koncentrace buněk ~ >107 buněk na ml média. Postupné zchlazování - V lázni s isopropylalkoholem (R.T.), přenos přímo do hlubokomrazícího boxu (~ -80oC), teplota klesá rychlostí ~ 1oC za 1 minutu - Zanořováním do par N2 - V termoisolačním materiálu (např. pěnový polystyren) přímo do hlubokomrazícího boxu, po 3 hodinách k trvalému uchování - V termoisolačním materiálu na ~ 2-4h do mrazícího boxu (-20oC), pak na 3 hodiny do hlubokomrazícího boxu, následně k trvalému uchování Rozmražování buněk Buňky je třeba rychle převést z hlubokého zamražení (~ 190oC) na kultivační teplotu, opláchnout zamražovací médium (centrifugací) a vyset k další kultivaci. Druhý den po vysetí je vhodné vyměnit kultivační médium za nové a odstranit tak zbytky buněk, které zamražení/rozmražení nepřežily. Dewarovy nádoby Kryo-zkumavky Přeprava buněk - V zamraženém stavu v tekutém N2 (v termosce, dálková, lokální přeprava) - V zamraženém stavu v isolačním boxu se suchým ledem (CO2) (na krátké i velké vzdálenosti, zásilkové společnosti mívají i službu s doplňováním suchého ledu) - Živé v kultuře, v kultivační nádobce s nadbytkem média (v závislosti na buněčném typu 1 – 3 dny), každopádně i zde je se třeba vyhnout teplotním výkyvům buňky nesmí zmrznou ani se přehřát => 0-40°C - Tkáně (s výjimkou krve) se přepravují podchlazené (ne zmrzlé) ve výživných médiích, často s kryo-protektivy Synchronizace buněk v buněčném cyklu Fyzikální metody - Setřásání mitotických buněk u adherentních kultur - Centrifugace (G0/G1 buňky jsou nejlehčí) a) v gradientu b) elutrace (centrifugace s protiproudem média) - FACS, sortrování pomocí flow-cytometru - Membránové vymývání (zdokonalená metoda setřásání) - Kontaktní inhibice Chemické metody - Deprivace odstraněním růstových faktorů (sérem) - Deprivace odstraněním iso-leucinu z média - Deprivace odstraněním Ca2+ - Přídavek hydroxyurei, inhibice RNA syntésy -> blok DNA syntézy - Dvojitý thymidinový blok - Mitotické jedy, inhibují reorganizaci mikrotubulů / dělícího vřeténka (kolchicin, kolcemid, nocodazol, …) – zejména zviditelnění chromozomů, karyotipyzace Fucci system (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator; Sakue-Sawano et al., 2008) Srovnání synchronizace v buněčném cyklu deprivací sérem (A) a kontaktní inhibicí (B) Příklad rozjezdu buněk synchronizovaných deprivací sérem myší fibroblasty linie NIH/3T3 Princip dvojitého bloku přídavkem nadbytku thymidinu - nadbytek thymidinu blokuje průchod S-fází buněčného cyklu, blokuje DNA syntézu Elutrační kyveta / hylzna - separace buněk pomocí protiproudého gradientu na speciální centrifuze - elutrátoru Současná kultivace více buněčných typů - Produkce růstových faktorů s parakrinním účinkem - Vhodné mechanické vlastnosti podkladu atd. V případě přímého kontaktu odlišení buněk na základě jejich vlastností - Exprese specifických proteinových markerů na povrchu buněk - Selekce díky expresi nějakého proteinu (enzymu, fluoreskujících proteinů,.. - Inhibice mitotické aktivity jednoho typu buněk (gama zářením, Mytomycinem C,..) Pokud je třeba maximálně minimalizovat riziko vzájemné kontaminace - Buňky v kultuře jsou odděleny polopropustnými membránami Imortalizace buněk Proč? - převedení primokultur v permanentní linie - zjednodušení kultivačních podmínek a) Spontánně – pomalé, často málo účinné b) Cíleně - fyzikálními faktory: Gama záření, Rentgenové záření (záření X), teplota - chemickými faktory: NiCl, NiSO4, Dimethylsulphate, N-methyl-N-nitrosouera (MNU), benzo[a]pyrene diol epoxide, 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) - biologickými faktory: viry - virus Epstein Barrové, virus myší leukémie, virus Rousova sarkomu, SV40 vektory (plasmidy / viry) exprimujícími transformující protein, např. antigen SV40 large T nebo adenovirus E1A,.. Cílené genetické manipulace Změny genetické informace, vložením, poškozením nebo vypnutím genu / genů - Vektory plasmidové a virové - Chemicky nebo fyzikálně – viz. imortalizace Vnesení vektoru do buněk a) Infekcí – viry b) Chemicky - lipofekce: obalení vektoru s lipidy a fúze komplexu s cytoplasmatickou membránou - Ca2+ precipitace: vysrážení vektoru na povrchu buněk v komplexu s Ca2+ a jeho pohlcení buňkou endocytózou - transfekce pomocí dextranu: komplex vektor / dextran spojený diethylaminoethylem je endocytován do buňky - transferofekce: vektor je navázán na transferin a přes transferinový receptor endocytován do buňky c) Mikroinjikace d) Elektroporace - narušení buněčné membrány elektrickým výbojem a difůze vektoru do buňky e) Nucleofekce - elektroporace v kombinaci s chemií, přenos vektoru do jádra f) Biolisticky – vektor navázaný na partikuli (zlato, wolfram) je vstřelen do tkáně, buněk Selekce buněčných klonů Adherentní buňky pod selekčním antibiotikem, při dostatečné nízké účinnosti transfekce nebo jejich konfluenci tvoří samostatné kolonie, které lze mechanicky, případně za pomoci proteáz (trypsin, kolagenáza) oddělit Suspenzní buňky pod selekčním antibiotikem je třeba rozklonovat mezním ředěním (někdy potřeba i u adherentních), nebo růst v polotekutém / viskózním médiu (agar apod.) Nejběžnější selekční antibiotika pro savčí buňky G418 / Neomycin, Hygromycin B, Puromycin Dodatek – TKÁNĚ a ORGÁNY Tkáně umíme kultivovat / připravovat jen velice omezeně, většinou jde pouze o uchování po určitou dobu, podobně jako orgány. U orgánů je již aktuální otázka přívodu živin, kyslíku a odvodu metabolitů a CO2. Orgány je tedy třeba mít metabolicky utlumeny (podchlazením) a nebo napojeny na oběh s živinami simulující krevní zásobení. V současné době je zvládnutá problematika krve (lze zamrazit), částečně pak epidermis / kůže a jaterní tkáně. Intenzivně se studují možnosti využití buněk pankretu (Langernhansových ostrůvků) z prasat. Velkým příslibem pro transplantace jsou také buňky a tkáně připravené z kmenových buněk. Epidermis – primokultury prasečích / lidských keratinocytů pěstované na syntetických nosičích se používají k regeneraci poškození epidermis po popáleninách apod. Částečné úspěchy jsou při přípravě umělých jater, kdy separované hepatocyty jsou vysety do reaktoru na rozvodné potrubí z polopropustných membrán. Celý takový bioreaktor pak připomíná skutečná játra s krevní oběhem a odvodem žluči. Hepatocyty se však zatím nedaří dostatečně efektivně zamražovat k dlouhodobému uskladnění a tak využití podle potřeby. Doporučená literatura: Lesko, J. a kol.: Práce s tkanivovými kulturami, Bratislava, Vydavatelstvo slovenskej akademie ved 1975, s. 212. Alberts, B. a kol.: Základy buněčné biologie. Úvod do molekulární biologie buňky. Ústí nad Labem, Espero Publishing 1998, 630 s. Alberts, B. a kol.: Molekular biology of the cell. New York & London, Garland Publishing, Inc. 1994, 1294 s. Spector, D. L. a kol.: Cells. A laboratory manual. Volumes 1, 2, 3. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998, 3 197 s. Cellis, J. E. a kol.: Cell Biology. A laboratory handbook. San Diego, London, Academic Press Inc. 1994, 1714 s. Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning. A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 1832 s. Ausubel, F. a kol.: Short Protocols in Molecular Biology. USA, Published by John Wiley & Sons Inc. 1995, 728 s.