Fig1 A/A G/G Single nucleotide polymorphisms (SNPs) Single nucleotide polymorphisms (SNPs) SNPs : nuclear genome (consensus) Proč nestačí jednoduše osekvenovat mtDNA? Introgrese mtDNA Berthier et al. 2006 Myotis myotis - Evropa Myotis blythii - Asie http://www.naturfoto.cz/fotografie/andera/netopyr-velky-xxx4242.jpg http://zmmu.msu.ru/bats/rusbats/pictures/mblythi2.jpg Příklad: Myotis blythii vs. Myotis myotis - introgrese mtDNA M. myotis - Evropa M. blythii - Asie samec Příklad: Myotis blythii vs. Myotis myotis - introgrese mtDNA M. myotis - Evropa M. blythii - Asie Tendence ke zpětnému křížení se samci M. blythii vedla k nárůstu proporce genomu M. blythii v Evropě Kolonizující (invazní) druh „ukradne“ mtDNA původnímu druhu (Currat et al. 2008) samec SNPs = single-locus genetic markers •SNPs (single nucleotide polymorphisms) – sekvenční polymorfismus • •kodominantní – je možné odlišit heterozygota (např. A/T) od homozygota (např. A/A) Př.: chromozóm 1 CAAGTA TGGACG CATGTA TGCACG CAAGTA TGGACG CAAGTA TGGACG A/T A/A Příklad informativního SNP znaku Fig1 transice A ↔ G transition: Pu®Pu or Py®Py transversion: Pu®Py or Py®Pu - fixovaný polymorfismus (homozygoti) – využití např. při studiu hybridizací (hybridi = heterozygoti) Značení heterozygotů N = A, C, G, T V = G, A, C D = G, A, T H = A, T, C B = G, T, C R = A, G Y = C, T M = A, C K = G, T S = G, C W = A, T Synonymní vs. nesynonymní substituce A/A G/G Využití SNPs znaků •obdobné jako u mikrosatelitů •identifikace druhu (nebo genetické skupiny) - studium hybridizace (+ introgrese částí genomu) •fylogeografie •populační genetika (genetická variabilita a struktura, tok genů, identifikace jedinců a vztahů mezi nimi, populační velikost a její změny atd.) •mutace ve funkčních genech – i záměna jedné aminokyseliny může mít fatální dopad •genome-wide genotyping – asociace s fenotypem Výhody •početné a rozšířené v genomu (v kódujících i nekódujících oblastech) – milióny lokusů •1 SNP cca každých 300-1000 bp (v rámci druhu) •Mendelovská dědičnost (vs. mtDNA) •evoluce je dobře popsatelná jednoduchým mutačním modelem (vs. microsatellites) •jsou analyzovány kratší fragmenty DNA – neinvazivní genetika Nevýhody •„ascertainment bias“ – výběr informativních znaků se provádí na základě jen malého počtu jedinců a nemusí být reprezentativní •nízká variabilita na lokus (většinou jen 2 alely) •pro populační genetiku je vyžadován větší počet lokusů (4-10 krát více než u mikrosatelitů) Metody analýzy 1.Nalezení lokusů („ascertainment“) 2.Genotypizace 1. Nalezení SNPs (1) CATS loci = comparative anchor tagged site loci (= cross amplification) (2) Genomic library = genome restriction + cloning (náhodný výběr klonů – 1 SNP každých 300-1000 bp) V současné době: Next-generation sequencing – sekvenování genomu více jedinců a hledání polymorfismů, např. tzv. RAD sequencing (viz další přednášky) hapmapfig2 Analýza NGS dat: Identifikace různých genotypů u různých jedinců (= homologních chromozómů, tj. variabilita alel) Individual 1-1 Individual 1-2 Individual 2-1 Individual 2-2 Ascertainment bias A-----T------C G-----A------G A-----T------C G-----A------C G-----A------C G-----A------G A-----T------C A-----T------C A-----T------C A-----T------C A-----T------C A-----T------C Analýza 3 jedinců u druhu (populace) 1 Tři polymorfní (informativní) SNPs Polymorfismus daných SNPs je druhově (populačně) specifický Druh (populace) 1 Druh (populace) 2 2. SNPs genotyping = zjištění genotypu daného jedince SNPs genotyping – sekvenování? Je drahé a nejasné u heterozygotů C T C/T Heterozygotes? Sekvenování z obou stran – are you really sure? A/C T/G SNPs genotyping – klonování a následné sekvenování? - rozdělení dvou alel (či více u duplikovaných genů) každý klon obsahuje jen jednu alelu vector = plasmid insert = only one PCR product ligation, transformation Ex.: heterozygote = two diff. alleles izolace vektorů obsahujících insert sekvenování insertů !!! cloning – cca 800 Kč !!! sequencing 1 clone – cca 100 Kč PCR is making substitution errors that are visualised by cloning (!) TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGG TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTCCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTGAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA ... před PCR = heterozygot G/C PCR artefacts (= šum při standardním sekvenování, ale velmi jasné při sekvenování klonů) SNPs genotyping 1.Old standards (PCR-based) •RFLP: PCR + štěpení + standardní elfo •DGGE, TGGE, SSCP: PCR + nestandardní elfo •původně diagnostika geneticky podmíněných chorob, např. cystická fibróza • 2.New methods (not based on standard PCR) •HRM: high-resolution melting (real-time PCR) •real-time PCR se specifickými sondami (TaqMan, molecular beacon) •ASPE: allele-specific primer extension • SBE: single base extension • SNP microarrays (GeneChip method) • • PCR-RFLP (restriction fragments length polymorphism) Enzyme Site Recognition • Each enzyme digests (cuts) DNA at a specific sequence = restriction site • Enzymes recognize 4- or 6- base pair, palindromic sequences (eg GAATTC) Palindrome Restriction site Fragment 1 Fragment 2 SNP genotyping - old standards „Jelenovi pivo nelej“ „A dál vidí lítat netopýry potentát i lid i vláda“ Běžné restrikční enzymy EcoRI – Eschericha coli – 5 prime overhang Pstl – Providencia stuartii – 3 prime overhang SmaI restriction enzyme recognition site.svg SmaI – blunt end „sticky ends“ „blunt ends“ SNP genotyping - old standards PCR-RFLP CCGATCAATGCGGCAA GGCTAGTTACGCCGTT CCGATCACTGCGGCAA GGCTAGTGACGCCGTT cutting by restriction endonuclease Allele A Allele C no cut - neumožní nalézt novou variantu daného SNP (odliší pouze 2 formy daného znaku: +/- ) SNPs genotyping – old standards electrophoresis methods of mutation detection •Thermal gradient gel electrophoresis (TGGE) •Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) •Single-strand conformation polymorphism (SSCP) • •= special electrophoresis methods based on differences in mobility of different DNA sequences • Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) (TGGE – podobné, ale gradient teploty) dgge Krátké PCR fragmenty (200-700 bp) jsou separovány v denaturačním gradientu (PAGE = polyakrylamidový gel) → v určitém bodě začně DNA denaturovat („melting point“) – závisí na sekvenci, tj. každá sekvence denaturuje při jiné koncentraci močoviny Denaturované fragmenty putují v gelu pomaleji Po obarvení lze vidět rozdílné pozice PCR produktů v závislosti na jejich sekvenci www.leveninc.com/cftr_ex.gif cftr_ex 1- normal homozygote 3- homozygous mutations will yield one band on a different position 2, 4, 5, 6 – heterozygous mutations will yield 4 bands (2 homozygous and 2 heterozygous) NOT ALL BANDS ARE SEEN !!!!! Detekce nových mutací – např. v diagnostice genetických chorob DGGE v bakteriální metagenomice http://www.biomedcentral.com/content/figures/1471-2164-11-488-1-l.jpg http://www.envirologek.com/orange/uploads/dgge-figure.png Dnes postupně nahrazováno NGS Single strand conformation polymorphism (SSCP) Homo1 Homo2 + - !!! non-denaturing PAGE Hetero radioisotopes silver-staining fluorescent dyes (SYBR gold) Allele 1 - C ...CGCTTCAGG ... ...GCGAAGTCC... ...CGCTTAAGG ... ...GCGAATTCC... Allele 2 - A heating - denaturation snap-cooling ® partial renaturation sequence-specific ssDNA conformations Použití automatických sekvenátorů (denaturing polymer POP7 – ssDNA, e.g. microsatellites – one labelled primer) Well controlled electrophoresis parameters, high sensitivity CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTT GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAA primer primer GAAAGAAAGAAAGAAA primer primer Msat paternita - Sekerak + - 125 bp 131 bp HEX HEX Použití automatických sekvenátorů Why not non-denaturing electrophoresis? - well controlled electrophoresis - - two fluorescent labels - high sensitivity e.g. CAP (conformation analysis polymer) Allele 1 Allele 2 FAM... CGCTTCAGG ... ... GCGAAGTCC ...HEX FAM... CGCTTAAGG ... ... GCGAATTCC ...HEX • MHC Class II (DQA gene) – mice HZ 2 3 1 2 1 2 1 4 1 hour, ~ 100 Kč/4 samples incl. PCR Information about all alleles (vs. cloning-sequencing) Analýza elektroforetogramů •např. GeneMapper (Applied Biosystems) •specifický „Size+Conformation Standard“ pro každou teplotu (konformace závisí na teplotě) •srovnání více vzorků •umožňuje detekci krátkých odlišných sekvencí s více SNPs (užitečné např. pro genotypizaci MHC, tj. vysoce variabilních genů) Použití 1)Genotyping of codominant markers (e.g. single copy MHC genes) • MHC Class II (DQA gene) – house mice 2 3 1 2 1 2 1 4 ... even shape of the peaks is important !!! Použití 1)Genotyping of codominant markers (e.g. single copy MHC genes) 2)Identification of number of genes (e.g. duplicated MHC genes) sscp SSCP of three individuals: - different alleles - same alleles Carpodacus erythrinus – MHC Class I (Promerová et al. 2009) Sedm píků stejné barvy= = alespoň čtyři kopie daného genu !!! Použití 1)Genotyping of codominant markers (e.g. single copy MHC genes) 2)Identification of number of genes (e.g. duplicated MHC genes) 3)Detection of PCR artefacts during cloning Detection of PCR artefacts during cloning TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGG TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTCCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTCAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA TTGAGGTCTCGTAGCTTCGA TTCAGGTCTCCTAGCTTCGA ... před PCR = heterozygot G/C • Jedinec s genotypem 1/2 Klon obsahující alelu 1 Klon obsahující alelu 2 Klon obsahující PCR artefact MHC Class II (DQA gene) – house mice Detection of PCR artefacts during cloning of heterozygotes SNP genotyping – new methods 1.high-resolution melting temperature (HRMT) 2. real-time PCR se specifickými sondami (TaqMan, molecular beacon) 3.ASPE: allele-specific primer extension 4. SBE: single base extension 5.Alelově-specifická hybridizace = not based on standard PCR mohou využívat tzv. microarrays („SNP chips“) 1. High-resolution melting temperature (HRMT) Step 1: real-time PCR = increase of fluorescence Step 2: measuring melting after PCR = decrease of fluorescence SANY0264zmenseny HRMT-popis2.JPG HRMT-popis.JPG HRMT genotyping Detekce heterozygotů - velmi levná a jednoduchá metoda – v podstatě jen qPCR - vhodná na genotypizace jednoduchých SNP u velkého množství vzorků 2. Real-time PCR se specifickou sondou 1) TaqMan sondy 2) Molecular Beacons („maják“) real-time PCR sondy specifické pro jednotlivé alely 3. ASPE: allele-specific primer extension CCGATCAATGCGGCAA CCGATCAATGCGGCAA T G • dvě PCR (každá se specifickými primery k danému SNP) • 3’ terminální nukleotid na primerech je komplementární k SNP nukleotidu • alelově-specifická amplifikace je umožněna vysoce specifickou polymerázou Úspěšná PCR Žádný PCR produkt ASPE: allele-specific primer extension (automatizovaná verze) • existují zoptimalizované multiplexy pro modelové druhy (např. člověk 1536 SNPs) • fluorescenční detekce (např. Illumina nebo LGC Genomics) Illumina – GoldenGate ASPE (web-based VeraCode Assay Designer) http://i.ytimg.com/vi/43-V76ZEAEY/hqdefault.jpg VeraCode Capture Beads fluorescenční detekce Kompetitive Alelle Specific PCR Cena analýzy („outsourcing“) LGC Genomics cost ABI Taqman® Assay by Design SNP assay design costs (validation) £1,620.00 £6,750.00 Genotyping cost £701.50 £388.80 Total £2,321.50 £7,138.80 Small scale study of 15 SNPs genotyped over 96 samples where no Assay on Demand (an alternative type of assay from ABI) SNP exists 4. SBE: single base extension CCGATCAATGCGGCAA CCGATCACTGCGGCAA T G - pouze jeden dideoxynukleotid je přidán k primeru - detekce různými metodami T G + - (A) Detekce SBE produktů kapilární elektroforézou + - kapilární elektroforéza SNaPShot Multiplex Kit (Life Technologies) „multiplex version“ – různě dlouhé primery, aby bylo možné odlišit různé lokusy (B) Detekce SBE produktů přes „microarray“ (tj. hybridizace) CCGATCACTGCGGCAA G tag – specifický pro každý lokus 1. 2. 3. 4. multicolor detection (using of 5’ oligonucleotide tags on SBE primers) tag-complementary probe – specifická sonda pro každý lokus multiplex PCR Illumina Infinium Bead Chip cca 300 000 SNP loci from 200 ng of DNA 5. Alelově specifická hybridizace Microarrays – SNPs chips Target (genomická DNA rozštěpená restrikčními enzymy) Probe (specifická sonda pro každou alelu) Microarray SNP Genotyping … ACT GGT CAT … (G) … ACT GTT CAT … (T) probes …ACTG?TCAT… …ACTG?TCAT… …ACTG?TCAT… Individual 1 Individual 2 Individual 3 targets G/G T/T G/T Detekce: např. Affymetrix - 10 tisíc – 1 milión SNP znaků najednou – „chip technology“ - např. Mouse Diversity Genotyping Array – 623 tisíc SNPs (je známa pozice každého z nich na genomu) - je možné si navrhnout vlastní Array Použití u příbuzných druhů je možné, ale je tam velmi silný „ascertainment bias“ Př. ascertainment bias: MegaMUGA chips Využívá Illumina Infinium technologii (single base extension) Použití pro nemodelové druhy („cross-genotyping“) DSC_5565 https://encrypted-tbn2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRtnPlK9dqm7DunHdesEsqptdG_ejIeeVnkAZk9EqDz5mq G2K_d Studium kontaktní zóny Mus minutoides ve východní Africe jedinec 1 jedinec 2 1620 informativních lokusů z 5598 lokusů na chromozómu 1 (60 SNPs fixovaných pro dané subpopulace v celém genomu) Dnes široká škála komerčních možností SNP genotyping pro nemodelové druhy – př. Illumina No. of loci: 3 000 – 1 milión 48-384 48 Samples/day 288 288 384