Koncepce předmětu spec. imunolog. metody Bi 9250C, zimní semestr 2015 Časový rozpis blokového cvičení z předmětu Speciální cvičení z imunologie 14 studentů, 2h/2kredity Pomůcky s sebou: Přezůvky a plášť, protokoly, svačina, Poznámky: k protokolu nutno přiložit fotky – vzít foťák či mobil; většina úloh bude probíhat ve dvojicích, proto je nutno se navzájem domluvit ještě před zahájením cvičení V praktickém cvičení se budeme zabývat testy sledujícími aktivitu IS a) bezobratlých b) obratlovců Metody: Odběr a zpracování krve (krevní diferenciál), Odběr a zpracování hemolymfy; Imunodifúze - Manciniová modifikace, popř. Ouchterlony; ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. (Borrelia afzelii, garinii, sensu stricto); Test aktivity lymfocytů; Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti Ag nebo Ab; Test ALT (stanovení aktivity jaterního enzymu), Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu); Test aktivity fagocytózy pomocí fagocytovaných částic u hemocytů hmyzu; Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka – nepřímá hemaglutinace (HIT). Termín: út.-pá. 9.2.-12.2. 016 od 8.30hod út 8:30 Instruktáž: ke cvičení toho dne 1. krevní roztěr, barvení a příprava séra 3. příprava destiček na ELISA, imunochromatograf. test HIV-v případě času, ruleta na imunochromatografické testy postupný odběr krve z prstu, ELISA - Et OH, promývání destiček, zjišťo vání koncentrace antigenu, ředění Ag, kalibrační křivka a napipetování na destičku; v mezičase bar vení roztěrů a krevní diferenciál; ruleta na imunochromatografický test, zpracování krve na sérum, Pomůcky: ELISA: připravené A volné destičky, Ag už sonifikovaný, albumin, činidla na kalibraci, vazebný rozt ok, lednička, et-OH Předání pokynů a protokolů na imunochromatografický test- ruleta ALT: sérum, ELISA reader s filtrem 340 nm, epiny, destičku Odběr krve: rukavice, ependorfky, stojánek, skla na roztěr, desinfekce, jehly, souprava na barvení- Leukodif Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, papírky na ruletu st 8:30 Instruktáž: 1. ALT 2. imunodifuze, 3. odběr hemolymfy z larev Zavíječe voskového, kultivace se škr obovými částicemi a sledování fagocytárních schopností hemolymfy, barvení skel a prohlížení pod mik rokopem 4. imunochromatografické testy ELISA-pokračování: odstranění Ag a promytí, napipetování vazebného roztoku s kaseinem, inkubace s k aseinem, promytí destiček; v mezičase imunochromatografické testy, mezitím imunodifúze; odběr hemolymfy z larev Zavíječe voskového, kultivace se škrobovými částicemi a sledování fagocytár ních schopností hemolymfy, barvení roztěrů a pozorování pod mikroskopem hemocytů, počítání FI a % F , krevní diferenciál – dokončení Imunodifúze: pipety, skla na imunodifúzi, vlhké komůrky, nůžky Pomůcky: ELISA: blokovací-vazebný roztok s kaseinem, promývací roztok, promývačka Fagocytóza: Leukodif, roztok škrobových zrn, larvy, sklíčka na roztěry, termostat, malé epiny, pinzety, nůžky, stříkačky a jehly Pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, teplotní lázeň, malý termostat čt 8:30 Instruktáž: 1. Test aktivity lymfocytů. 2. Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka, v mezičase počítání krevní diferenciál Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu), barvení buněk -dokončení Test aktivity fagocytózy pomocí škrobových zrn u fagocytů hmyzu, barvení buněk - dokončení Pomůcky: Komerční séra (EXBIO Olomouc) anti-A (IgM) monoklonální1, anti-B (IgM) monoklonální, lektin anti-H monoklonální; náplav diagnostických erytrocytů A,B,O; destičky s otvory, fyziologický roztok 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl, vodní lázeň na 100 C°, vortex, stojánky na zkumavky, štítky, fixy. pá 8:30 Instruktáž: 1. samotná ELISA Ředění sér, rozložení vzorků na destičku, příprava zředěných sér: inkubace destičky se séry (naředit konjugát), promytí destičky, nanesení konjugátu, inkubace s konjugátem (nachystat substrátový roztok s OPD), promytí a nanesení substr. roztoku, inkubace se substrátem, zastavení reakce pomocí H[2]SO[4], měření na ELISA-readeru, v mezičase: krevní diferenciál, FI, % fagocytózy. Pomůcky: ELISA: blokovací roztok, promývací roztok, promývačka, konjugát, substrátový roztok, substrát, H[2]SO[4], ELISA-reader na 492 nm Pipety, špičky, stojánky, ependorfky Přehled imunochromatografických metod: Rychlý kvalitativní test pro časné potvrzení těhotenství 1x Rychlý kvalitativní test pro stanovení přítomnosti HIV viru 14x Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti hemoglobinu ve stolici - individuální stanovení 3x Rychlý test ze slin pro odhad hladiny alkoholu v krvi 2x Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti H. pylori ve stolici 3x Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti S. pneumoniae v moči 3x Rychlý kvalitativní test pro stanovení přítomnosti Treponema pallidum