Bi9393 Analytická cytometrie
Biofyzikální ústav AVČR
Královopolská 135
612 65 Brno
e-mail: ksoucek@ibp.cz
tel.: 541 517 166
Karel Souček, Ph.D.
Lukáš Kubala, Ph.D.
Eva Bártová, Ph.D.
Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D.
Struktura kurzu
 Přednášky
- 7 lekcí o průtokové cytometrii a aplikacích
- 1 lekce o in vivo zobrazovacích metodách
- 1 lekce o mikroskopických technikách
- 2 lekce studentských prezentací
 Bi9393c Analytická cytometrie-cvičení
 Navazuje na přednášky z oblasti průtokové cytometrie
 Test
Kurz bude zakončen zkouškou ve formě testu shrnujícího látku za celý semestr. Výsledek testu
bude tvořit 75% celkového hodnocení.
 Seminář
Každý student bude prezentovat krátký seminář jehož téma bude konzultováno s přednášejícím
a bude se týkat zaměření kurzu. Téma semináře bude shrnuto v krátkém textu ve stylu
hesla pro CZ Wikipedii. Na základě této prezentace a odevzdaného textu bude udělen
zápočet a hodnocení vlastního semináře se bude také z 25-ti % odrážet v celkové známce.
Seminář studentů
 Téma semináře musí vycházet z probírané
technologie/metodologie a musí být
schváleno přednášejícím.
 Cílem je demonstrovat pochopení principů ze
kterých vychází a jejich uplatnění v biologii.
 Prezentace musí být připravena např. v
PowerPoint(u). Prezentaci je doporučeno
předložit v předstihu přednášejícímu ke
konzultaci a posouzení.
 Délka prezentace je 10 minut.
 Obsah prezentace shrnout v krátkém „Wiki“
textu.
Seminář studentů – příklady témat
 Základní principy průtokové cytometrie
 Analýza dat z průtokového cytomeru
 Základní principy separace pomocí průtokové cytometrie
 Principy fluorescence a fluorescenční značky
 Základy detekce fluorescence a zpracování signálu.
 Aplikace průtokové cytometrie
– Imunofenotypová analýza krevních destiček.
– Využití průtokové cytometrie v diagnostice alergických onemocnění.
– Analýza DNA pomocí průtokové cytometrie.
– Aplikace průtokové cytometrie při studiu imunologie bezobratlých.
– Chromozómová analýza pomocí fluorescenční mikroskopie a průtokové cytometrie.
– Extracelulární detekce cytokinů.
– Monoklonální protilátky v průtokové cytometrii.
– Imunofenotypová analýza periferních lymfocytů.
– Využití průtokové cytometrie v cytogenetice.
– Stanovení buněčné viability.
– Metody detekce apoptózy.
– Měření enzymatických aktivit pomocí průtokové cytometrie.
– Zdroje excitace a optické systémy v průtokové cytometrii.
– Detekce CD4+ T buněk u HIV pozitivních pacientů.
– Aplikace FRET a FRAP.
– Víceparametrové analýzy v průtokové cytometrii.
– Průtoková cytometrie v diagnostice nádorových onemocnění.
– Intracelulární detekce cytokinů.
– Imunofenotypová analýza krevních destiček.
– Využití průtokové cytometrie v diagnostice alergických onemocnění.
Informační zdroje – průtoková
cytometrie
 Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley-Liss; 4th edition
 Cytometry: New Developments, Volume 75, Fourth Edition (Methods in
Cell Biology), Zbigniew Darzynkiewicz, Academic Press; 4th edition
 Průtoková cytometrie v klinické praxi, T. Eckschlager a kol., Grada 1999
 Flow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes, Chromosomes and
Genomes; Jaroslav Dolezel (Editor), Johann Greilhuber (Editor), Jan Suda
(Editor), February 2007
Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na:
http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/books/bookindx.htm
Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ.
Informační zdroje – průtoková
cytometrie (metody a protokoly)
 The Handbook of Flow Cytometry Methods
 Current Protocols in Cytometry
Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ.
www.cyto.purdue.edu/.../slide0046_image018.jpg
Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na:
http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/books/bookindx.htm
Informační zdroje – cytometrie
(časopisy)
 Cytometry Part A
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/33945
 Cytometry Part B: Clinical Cytometry
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/jhome/102019902
Jednotlivá čísla Cytometry Part A (od roku je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ.
Informační zdroje – cytometrie
(CD-ROM)
Je možné zapůjčit po domluvě.
Informační zdroje – (Internet)
 Purdue University, Cytometry Labs
http://www.cyto.purdue.edu/
 International Society for Analytical
Cytology
http://www.isac-net.org/
 Molecular Probes (Invitrogen)
http://probes.invitrogen.com/handbook/
Informační zdroje - mikroskopie
 Taatjes D. J. Cell Imaging Techniques, Methods and Protocols,
Humana Press, Totowa, New Jersey, 2005
 Stephens D. Cell Imaging, Scion Publishing Ltd., 2006.
 Pawley, J. (Ed.), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed.,
2006
Tyto knihy je možné zapůjčit ke studiu do knihovny BFÚ.
Informační zdroje - microarrays
 Microarray Analysis, Mark Schena, Wiley-Liss 2003
 Guide to Analysis of DNA Microarray Data, Second Edition, Steen
Knudsen, Wiley-Liss 2004
 DNA microarrays: a molecular clonning manual. Bowtell D, Sambrook
J., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2003.
Tyto knihy je možné zapůjčit po domluvě ke studiu do knihovny BFÚ.
https://www.youtube.com/watch?v=ija8tohI4aY
Years
197619771978197919801981198219831984198519861987198819891990199119921993199419951996199719981999200020012002200320042005200620072008200920102011201220132014
Papers
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
200000
400000
600000
800000
1000000
flow cytometry
confocal microscopy
all
Cytometry Publications/Year
Data taken from
Obecný úvod do průtokové
cytometrie
 Základní principy, možnosti průtokové
cytometrie a její aplikace
 Historie
Tyto částice mají něco společného …
Algae
ChromosomesBlood cells
Protozoa
… určité parametry těchto částic mohou být měřeny
pomocí průtokové cytometrie.
Komerční zařízení a vývoj
Co je průtokový cytometr?
Co můžeme analyzovat pomocí
průtokové cytometrie?
 Počítat částice v suspenzi
 Oddělit živé částice od neživých
 Hodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně
než 1 minutu
 Kvantifikovat rozptyl světla, ale i
intenzitu fluorescence
 Fyzicky separovat jednotlivé částice
(populace) pro další analýzu
Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Jaké jsou principy?
 Rozptyl světla (Light scatter) pomocí laseru
nebo UV lampy
 Detekce specifické flurescence
 Hydrodynamicky zaostřený proud částic
 Elektrostatická separace částic
 Možnost multivariační analýzy dat
Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Definice
 Průtoková cytometrie (flow
cytometry)
– Meření vlastností proudících částic (buněk)
– také známo jako Fluorescence-Activated
Cell Sorting (FACS)
 Průtoková separace (flow sorting)
– fyzická separace částic (buněk) na základě
parametrů měřených průtokovou cytometrií
Technické součásti
Zdroje světla
Detekční systémy
Fluidní systém
Separace
Sběr dat
Analýza dat
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Technické součásti
Detekční systémy
Fotonásobiče (Photomultiplier Tubes (PMTs))
dříve 1-2
nyní 3-8
Diody
detekce rozptylu světla (light scatters)
Zdroje světla
Lasery (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm)
Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag
UV (Arc) Lampy
Mercury, Mercury-Xenon
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Stain Your Own Cell
Historie barvení biologických materiálů
Až do poloviny 19. století – byly používány pouze přírodní barviva
Anton van Leeuwenhoek použil v roce 1719 šafrán na
obarvení svalových buněk
www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html
Historie barvení biologických materiálů
Paul Ehrlich - 1879 použil kyselá a zásaditá barviva pro
odlišení acidofilních,eosinofilních a neutrofilních
leukocytů
Clin Lab Med. 1993 Dec;13(4):759-71.
The Ehrlich-Chenzinsky-Plehn-
Malachowski-Romanowsky-Nocht-
Jenner-May-Grunwald-Leishman-
Reuter-Wright-Giemsa-Lillie-Roe-Wilcox
stain. The mystery unfolds.
Woronzoff-Dashkoff KP.
Princip fluorescenčního Mikroskopu - August Köhler - 1904
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/anatomy.html
Historie barvení biologických materiálů
Andrew Moldavan
Není jasné zda
Moldavan vůbec svůj
„počítač buněk“ sestrojil.
Ve svém, článku popisuje
mnoho problémů, ale
žádné výsledky.
Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells
Andrew Moldavan
Montreal, Canada
Science 80:188-189, 1934
Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells
Andrew Moldavan
Montreal, Canada
Science 80:188-189, 1934
“The purpose of the experiment
is to have each microscopical
cell passing through the
capillary tube, register itself
automatically on the
photoelectric apparatus, thus
creating a micro-current which
can be amplified and recorded.”
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Coons et al 1941 – vyvinuli techniku
fluorescenčního značení protilátek - označili
anti-pneumokokové protilátky pomocí
antracénu. To jim umožnilo detekovat
protilátky i patogeny v tkáni pomocí UV
fluorescence.
Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group
Albert H. Coons, Hugh J. Creech and R. Norman Jones
Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, and the Chemical Laboratory, Harvard University
Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 47:200-202, 1941
Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group
Albert H. Coons, Hugh J. Creech and R. Norman Jones
Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, and the Chemical Laboratory, Harvard University
Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 47:200-202, 1941
“Moreover, when Type II and III
organisms were dried on different parts of
the same slide, exposed to the conjugate
for 30 minutes, washed in saline and
distilled water, and mounted in glycerol,
individual Type III organisms could be
seen with the fluorescence
microscope……”
Coons a Kaplan (1950) - konjugovali fluorescein s isokyanátem
(FITC) – získali lepší signál – dále od autofluorescence.
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Friedman
Friedman (1950) – kombinoval kyselý
fuchsin, akridinovou žlut´a berberin pro
detekci buněk nádorů dělohy pomocí
fluorescenčního microskopu
Acid Fuchsin
Acid magenta
Acid rubin
Acid roseine
Absorption Max 540-545
von Bertalanffy & Bickis
Ludwig von Bertalanffy (1901-1972)
von Bertalanffy & Bickis (1956)
- metachromatická fluorescence Akridinové oranže byla použita pro detekci RNA v
tkáni
- použili ji také pro rozlišení normálních a nádorových buněk
Absorption Max 467 nm
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Gucker - 1947
 Vyvinul průtokový cytometr pro detekci baktérií v
aerosolu.
 Utajená práce vynikala během Druhé světové války
a byla publikována v roce 1947.
 Cílem byla rychlá detekce vzdušných spór a baktérii
během válečného konfliktu.
 Instrument: Proudí vzduch procházel skrz
osvětlenou komůrku. Jako zdroj světla sloužila
lampa ze světlometu a pro detekci byl použit
fotonásobič.
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
P.J. Crossland-Taylor
„Sheath Flow“ princip
“Provided there is no turbulence,
the wide column of particles will
then be accelerated to form a
narrow column surrounded by
fluid of the same refractive index
which in turn is enclosed in a
tube which will not interfere with
observation of its axial content.”
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Wallace Coulter
 Wallace Coulter Coulter
orifice - 1956 
(patent 1953) – měření
změny vodivosti během
průchodu buněk v
suspenzi malým otvorem
Originální
patentová
aplikace
W.Coultera 1953
Photo by J.Paul Robinson
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Jak počítat buňky?
 Hemocytometer (Bürkerova komůrka) byla
standardem pro počítání buněk do ~ 1950
 Rozměry jsou 3x3x0.1 mm. Obvykle jsou červené
krvinky (1 x 106/mm3 )počítány po naředění 1:200
 Leukocyty (5x103/mm3) jsou ředěny 1:10 v roztoku
lyzujícím červené krvinky
 Statistická chyba:
– koeficient variance (CV) je při 500 spočítaných buňkách
4.4%
– chyba pipetování a ředění je ~ 10%
Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Roche Innovatis
Cedex
Coulter Counter
První komerční verze CC
Coulter Counter
© CC
Beckman Coulter
 Multisizer™ 3&4 COULTER COUNTER®
Roche Innovatis
CASY TT
Cytograph. Stolní přístroj schopný měřit rozptyl světla He-Ne laseru (1970).
Mack Fulwyler- sorter
Mack Fulwyler - sorter 1965 - Los Alamos National Labs – jeho sorter separoval částice
na základě elektronicky měřeného objemu (stejný princip jako Coulter counter) a
separoval pomocí elektrostatického vychýlení.
Cílem bylo sortrovat červené krvinky,protože u nich byla naměřena bimodální distribuce
buněčného objemu. Princip separace byl založen na principu inkoustové tiskárny
Richarda Sweeta ze Stanfordu (1965)
Po té co bylo objasněno, že bimodalita červených krvinek je artefakt byla tato skupina schopna separovat neutrofily a lymfocyty z krve.
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Richard Sweet
Richard Sweet vyvinul elektrostatickou
inkoustovou tiskárnu jejíž princip využil
Mack Fulwyler pro svůj buněčný sorter.
J.P. Robinson Purdue University BMS 631
Mack Fulwyler- sorter
Mack Fulwyler- sorter
K. Souček
Leonard Arthur "Len" Herzenberg
Klíčové „cytometrické“ publikace
 1934: Moldovan – Fotoelektrické meření buněk v kapiláře
 1947: Gucker – fotoelektrické počítání buněk
 1949: Coultrův počítač částic
 1961: Rotman poprvé používá fluorescenci pro kvantifikaci enzymatické reakce
 1964: Sweet – elektrostatická inkoustová tiskárna
 1965: Fulwyler – květen 1965 - patent elektrostatického sorteru
 1965: Kanetsky – spektrofotometrické měření buněk
 1965: Fulwyler – listopad 1965 – publikace o buněčné separaci v časopise Science
 1968: Gohde – první článek o fluorescenční průtokové cytometrii (v němčině)
 1969: Gohde – patent
 1969: Van Dilla – druhý článek o fluorescenční průtokové cytometrii
 1969: Mullaney – první článek věnující se popisu rozptylu světla jako cytometrického
parametru
 1969: Heryenberg – třetí článek o fluorescenční průtokové cytometrii
 1973: Gohde – patent dvojího značení
 1977: Gohde – popis kompenzací signálu při dvojtém značení
 1978: Kachel – flow imaging – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu
 1983: izolace a detekce jader (DNA) z tkání zalitých v parafínu
 1984: kongres o nomenklatuře cytometrie DNA
 1987: Graz - vysokorychlostní sortrování chromozómů
 1991: Robinson – automatizace klinických systémů – průtokový cytometr a čtečka
čárkových kódů
Zdroj – ISAC 2006 –The Wall of History
K čemu to všechno je… například…
K čemu to všechno je… například…
 43 miliónů lidí na světě je infikováno virem HIV (WHO)
 ročně zemře ~ 2 miliónu lidí na HIV/AIDS (v Africe je ~ 11 miliónu AIDS sirotků)
 kvantifikace CD4 T lymfocytů je klíčový parametr při monitorování léčby
 Průtoková cytometrie je „zlatý standard“
 Optimalizované postupy a zařízení pro levné (< 3 EUR / vzorek) a rychlé detekce (250
vzorků / den)
 Aydogan Ozcan: „Kill the cost, safe live“
Flow Cytometry On-a-Chip
 MAGNETIC COUNTING
– RESEARCHER: Hakho Lee, Assistant Professor of Radiology, Harvard Medical School
PROJECT: Enumerating and characterizing circulating tumor cells
PROBLEM: Circulating tumor cells (CTCs) are incredibly rare, with just a handful per milliliter of human blood.
SOLUTION: Lee’s group fabricated a hybrid microfluidic device out of polydimethylsiloxane (PDMS) that can count CTCs in
real time using tiny sensors called micro-Hall detectors. (Sci Transl Med, 4:141ra92, 2012)
 PCR-ACTIVATED SORTING
– RESEARCHER: Adam Abate, Assistant Professor of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California,
San Francisco
PROJECT: Analysis of rare, uncultivable microbes
PROBLEM: Developing specific antibodies for bacteria that cannot be cultured
SOLUTION: As a postdoc in the Harvard University lab of droplet-based microfluidics pioneer David Weitz, Abate
codeveloped a device that could sort droplets according to their fluorescence intensity. Unlike traditional microfluidics, in
which molecules and cells flow naked through channels, droplet-based devices encapsulate molecules or cells in uniform,
picoliter-scale aqueous reaction chambers encased in oil.
 SORTING BY CELL DEFORMABILITY
– PROJECT: Cancer cell phenotyping
PROBLEM: Not every cell type has a known antigen that defines it. Plus, antibody binding may activate receptors,
potentially changing the cell’s behavior.
SOLUTION: A physicist by training, Guck used laser beams in his graduate work to study the physical properties of cells.
Not all cells are equally squishy, he found: while normal cells are relatively rigid, cancer cells are more pliable. “The more
aggressive the cell, the softer it is, and that may be necessary for it to pass into tissues,” Guck explains.
 RAMAN-ACTIVATED CELL SORTING
– RESEARCHER: Jian Xu, Professor and Director, and Bo Ma, Group Lead of Microfluidics, Single-Cell Center, Qingdao
Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences
PROJECT: Microbial biofuels development
PROBLEM: Biofuels R&D requires identifying cells capable of specific carbon chemistries. But as these cells have yet to be
cultured and studied, researchers have few if any molecular hooks for identifying and sorting them.
SOLUTION: The team turned to a label-free method of single-cell interrogation known as Raman-activated cell sorting
(RACS) (Anal Chem, 87:2282-89, 2015).
http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/43034/title/Flow-Cytometry-On-a-Chip/
Co tomu předcházelo…a čeho
jsme i nyní součástí…
 Rozvoj techniky umožňující rychlou a
reprodukovatelnou detekci cytometrických
parametrů.
 Nové vědecké poznatky vedoucí k definici
vhodných diagnostických markerů.
http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/start.htm?loc=http://www.cyt
o.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/video/video.html?v=Flowtheinvention.wmv
ISAC presents: Mack Fulwyler Innovator,
Inventor & Pioneer
http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto10a/seminalcontributions/fulwyl
er.html
https://www.youtube.com/watch?v=3s5l2mepKkY
Shrnutí přednášky
 Úvod do kurzu
 Zdroje literatury
 Historie průtokové cytometrie
 Základní principy
Na konci dnešní přednášky byste měli:
1. vědět jaké jsou požadavky pro tento kurz
2. znát základní zdroje informací
3. mít stručný přehled o historii průtokové cytometrie
4. orientovat se v některých základních principech průtokové cytometrie