MONOKLONÁLNE PROTILÁTKY V ANALYTICKEJ CYTOMETRII
Dominika Melničuková
408622

História
—Leonard Arthur "Len" Herzenberg
— (5.11.1931 – 27.10.2013)
—
—FACS
— (fluorescence-activated cell sorting)
—
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/8/8e/LenHerzenberg.jpg/220px-LenHerzenberg.jpg
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/8/8e/LenHerzenberg.jpg/220px-LenHerzenberg.jpg

Monoklonálne protilátky
—Monoklonálna protilátka (imunoglobulín) je protilátka získaná z klonálnej populácie jednej
plazmatickej bunky (B-lymfocytu).
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2d/Antibody.svg/255px-Antibody.svg.png
https://en.wikipedia.org/wiki/Antibody#/media/File:Antibody.svg
C:\Users\Dominika\Desktop\production_illust.jpg
http://www.kyowa-kirin.co.jp/antibody/english/img/about/production_illust.jpg (upravené)

Protilátky a analytická cytometria
—Imunofenotypizácia.
—Najčastejšie IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b)
—
—Využívajú sa fluorescenčne značené protilátky.
—
—Metóda voľby pre identifikáciu a triedenie bunkových komplexov.
—
—Základný výskum, klinické laboratóriá.

Fluorescenčné značenie protilátok
—
—Lightning-Link®

Príprava vzoriek
—Potreba suspenzie jednotlivých buniek
—Značenie povrchových antigénov - inkubácia s protilátkami
—Značenie intracelulárnych antigénov - fixácia a permeabilizácia (neexistuje žiadny štandardný
postup).
—

Značenie buniek
—Priame značenie využíva jednu protilátku na značenie cieľa (primárna protilátka). Protilátka je
priamo konjugovaná s fluoroforom.
—Nepriame značenie využíva dve protilátky. Primárnu nekonjugovanú a sekundárnu konjugovanú s
fluoroforom, ktorá sa viaže na primárnu protilátku.
http://a.static-abcam.com/CmsMedia/Media/direct-vs-indirect-immunofluorescence.jpg
http://www.abcam.com/secondary-antibodies/direct-vs-indirect-immunofluorescence

Čo sa používa?
—Priame značenie – monoklonálna protilátka konjugovaná s fluoroforom.
—
—Nepriame značenie – polyvalentná (viac strán na primárnej Ab) alebo monoklonálna protilátka,
špecifická pre Ig typ primárnej protilátky. Protein A, biotin-avidin.
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Images/integration/avidin-biotin-complex-alone.jp
g
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Images/integration/avidin-biotin-complex-alone.jp
g

Obe metódy majú svoje výhody a nevýhody



Optimalizácia- Koncentrácia protilátok
—Prečo titrujeme?
•Pre optimalizáciu signálu, dosiahnutie celkového nasýtenia, minimalizovanie signálu pozadia a pre
zachovanie reagencie (šetrenie peňazí J).
•
—Väčšinou udávaná výrobcom. ALE!
—
—

Príklad titračného experimentu
titration1
http://bitesizebio.s3.amazonaws.com/wp-content/uploads/2014/12/titration11.jpg
http://bitesizebio.s3.amazonaws.com/wp-content/uploads/2014/12/titration2.jpg
http://bitesizebio.s3.amazonaws.com/wp-content/uploads/2014/12/titration2.jpg
http://bitesizebio.s3.amazonaws.com/wp-content/uploads/2014/12/titration3.jpg
http://bitesizebio.s3.amazonaws.com/wp-content/uploads/2014/12/titration3.jpg

Izotypová kontrola
—Prečo?
•Potvrdenie špecifickosti primárnej väzby protilátky.
•Vylúčenie nešpecifického naviazania Fc receptora alebo inej bunkovej proteínovej interakcie.
—Mala by zodpovedať charakteristikám primárnej protilátky :
◦Hostiteľský druh
◦Izotypová forma
◦Forma konjugácie
◦Je namierená proti antigénu, ktorý sa v bunke nenachádza.
•

http://static.enzolifesciences.com/fileadmin/files/image/SAB-600FI_FC.jpg
http://static.enzolifesciences.com/fileadmin/files/image/SAB-600FI_FC.jpg
—Negatívna kontrola/Kontrola autofluorescencie pozadia
—

Ďakujem za pozornosť!
epitope (antigen) : paratope (antibody) v-day card: