Jana Zsoldosová
Využití průtokové cytometrie v
diagnostice alergických onemocnění
Alergie
 = hypersenzitivní reakce zprostředkovaná imunitními
mechanismy (humorálními a buněčnými)
 = skupina chorob, u nichž dochází k opakované expozici
škodlivými antigeny z vnějšího prostředí (alergenům)
 navození zánětlivých změn  porucha struktury a funkce
Krejsek a kol., 2004; Hořejší a kol., 2009
Léčba alergií
 profylace
 farmaka
 antihistaminika – blokují receptory pro histamin
 kortikoidy – inhibice syntézy histaminu, protizánětlivé
 kromoglykát – inhibice degranulace ovlivněním vlastností
membrány mastocytů
 tzv. alergenová imunoterapie – postupné zvyšování
dávky alergenu
Hořejší a kol., 2009
Diagnostika alergických onemocnění
 anamnéza – možné příčiny vzniku alergie
 kožní testy – rychlost, spolehlivost, jednoduchost
 prick testy, intradermální testy – k průkazu časné přecitlivělosti
 epikutánní testy – k průkazu pozdní přecitlivělosti
 provokační testy – klinické projevy po kontaktu s alergenem
 diagnostika alergických onemocnění z povolání
 stanovení celkového množství IgE
 zvýšená koncentrace nemusí doprovázet IgE zprostředkovanou
alergickou reakci
 stanovení koncentrace specifických IgE (sIgE)
 RAST, FAST, Immulite, CAP – princip ELISA techniky
Špičák a kol. 2004; Krejsek a kol. 2004; Honzová a kol., 2003; Honzová, 2009
Bazofily a žírné buňky
Honzová, 2009; Pichler, 2007
 primární efektorové buňky v IgE zprostředkované
reakci I. Typu
 syntéza mediátorů alergické reakce – zejm. histamin
 exprimují vysokoafinitní receptor pro IgE (FceRI)
 IgE zprostředkovaná reakce – přemostění sousedních
sIgE alergenem  splynutí granul  uvolnění granul
vázajících histamin a heparin
 = degranulace
Testy sledující aktivaci bazofilů
Honzová, 2009; Valent a kol., 2009; De Weck a kol., 2008; Ebo a kol., 2008; Boumiza a kol., 2007
 Test uvolňování histaminu
 závislé na povaze nemoci, příjem léků, hormonů, přítomnost
cytokinů,..
 5% jedinců nereaguje
 CAST - cellular allergen stimulation test
 test založený na uvolňování sulfidoleukotrienů
 Nevýhody
 Nutnost izolace  riziko nespecifické stimulace
 Plná krev – mediátory z monocytů, eosinofilů
 BAT – test aktivace bazofilů
 komerční kity – Bazotest, FAST
 s využitím průtokové cytometrie
 sledování membránových znaků
Test aktivace bazofilů (BAT)
 průlom 1994 – objev CD63 znaku bazofilní aktivace
 1999 – objevení znaku CD203c
 jednoznačná identifikace bazofilů
 znak aktivace – exprese se zvyšuje během aktivace bazofilů
 CD63
 proteinová molekula (53 kDa) - glykoprotein
 exprimovaná na cytoplazmatických granulích klidových bb
 na aktivovaných bazofilech
 monocyty, makrofágy, trombocyty
 CD203c
 enzym
 exprese se zvyšuje během aktivace
 přítomen u klidových bazofilů
Sainte-Laudy a kol. 1994; Ebo a kol., 2006; Wolanczyk-Medrala a kol. 2009; Havranová a kol., 2006; Ebo a kol.,
2008; Pichler, 2007; Boumiza a kol., 2007
Hlavní vlastnosti aktivačních markerů
Ebo a kol., 2006
CD63 CD203c
Synonyms Gp53, LAMP-3 (lysosymeassociated
membrane
protein)
Neural cell surface
differentiation antigen E-
NPP3
(Super) family Transmembrane-4 super
family (tetraspanins)
Pyrophosphatase/phospho
diesterase
Resting
basophils
Barely detectable Consitutively present
IgE –activated
basophils
Upregulation starts within
10 min
Expressed with a high
density (at least 1 log scale)
Upregulation starts within
5 min and peaks within 10
– 15 min
Upregulation less
prominent when compared
with CD63
 citlivá a specifická metoda
 v diagnostice IgE-zprostředkované alergické reakce (i nonIgE
reakce)
 inhalační alergeny, přírodní alergie na latex, alergie na jídlo,
léky, autoprotilátky u chronické kopřivky, alergie na vosí, včelí
jed,..
 monitoring imunoterapie
 indikace – kožní testy a vyšetření specifických IgE protilátek –
NELZE
 výsledky neodpovídající klinické anamnéze
 problematické alergeny – jed blanokřídlého hmyzu, lékové
alergie
Ebo a kol., 2006, Wolanczyk-Medrala a kol., 2009, De Weck a kol., 2008, Pichler, 2007; Valent a kol., 2004; Bidad a
kol., 2014; Havranová a kol., 2006; Eberlein-König a kol., 2006; Boumiza a kol., 2007; Sainte-Laudy
Použití
Provedení:
Valent a kol., 2004; Havranová a kol., 2003
 heparinizovaná krev + IL-3
 stimulace vodnými roztoky alergenů - inkubace 10 min při 37°C na
vodní lázni
 do zkumavky:
 pozitivní kontrola
 negativní kontrola
 inkubace 20 min při 37°C
 zastavení reakce na ledu
 přídavek dvou druhů fluorescenčně značených protilátek
 protilátka k identifikaci bazofilů – anti-CD203c, anti-IgE
 (anti IgE-PE-Cy5, 203cPE)
 protilátka, která se váže na aktivační znaky – anti-CD63
 CD63 FITC
 inkubace 30 min ve tmě při 2 - 8°C
 lýza erytrocytů  centrifugace
 slití supernatantu
 FACS
 preanalytická fáze
 odběr do antikoagulačního činidla – heparin, EDTA
 skladování s EDTA – 24 hodin při 4°C
 interference
 léky (vynechat před odběrem)
 alergická reakce před odběrem – falešně negativní
výsledky
 test s plnou krví x s izolovanými bazofily
• jednodušší
• rychlejší
• aktivace v přirozeném prostředí
• interference se složkami krevní
plazmy?
• časově náročnější
• větší množství krve
• nespecifická aktivace buněk
Valent a kol., 2004; Ebo a kol., 2008; De Weck a kol., 2008; Pichler, 2007
Zpracování vzorku I
 preinkubace – krev s IL-3 (stimulace bazofilů)
 aktivace alergenem
 přírodní alergenové extrakty – heterogenní
 rekombinantní
 se vzorkem – pozitivní i negativní kontrola
 pozitivní kontrola – anti-IgE protilátka, fMLP
 negativní kontrola – ředící roztok
 identifikační znaky
 protilátka proti IgE
 IgE i na jiných buňkách (př. na monocytech) – odlišení anti-HLA-DR protilátka
 různé množství IgE a receptorů
 CD203c – specifičtější
 i zhodnocení stavu aktivace
 CCR2 (eotaxin CC chemokin receptor-3) – nespecifický
 CRTH2 (DP2)
Pichler, 2007; De Weck a kol., 2008; Honzová, 2003; Valent a kol., 2004; Havranová a kol., 2006; Ebo a kol., 2008;
Boumiza a kol., 2005
Zpracování vzorku II
Ebo a kol., 2006
Pichler, 2007
 výsledek
 % aktivovaných bazofilů
 u některých alergenů – tzv. stimulační index
 absolutní počet hodnocených bazofilů (>150)
Ebo a kol., 2006; Ebo a kol., 2008; De Weck a kol., 2008; Pichler, 2007; Havranová a kol., 2006; Honzová a
kol., 2003; Hagau a kol., 2013; Valent a kol., 2004
SI =
% bazofilů po stimulaci alergenem
% bazofilů bez stimulace nebo negativní kontrola
Interpretace
Alternativy
 modifikace
 kombinace protilátek CRTH2/CD203c/CD3/CCR3
 anti-CD203c – pouze k měření aktivace
 anti-CRTH2 a anti-CD3 – detekce bazofilů
 nepřínosné
 znaky nové generace – CD13, CD164, CD107a a
CD107b
 spojené s degranulací
 využití jako aktivační znaky pomocí průtokové cytometrie?
 odlišné doby aktivace
Ebo a kol., 2008; Havranová a kol., 2006; Boumiza a kol., 2005; Hennersdorf a kol., 2005; Pichler, 2007; De Weck, 2008
Senzitivita a specifita BAT
Honzová a kol., 2003; Eberlein-König a kol., 2006
alergie senzitivita (%) specifita (%)
na inhalační alergeny 91 - 93 98 - 100
potravinové alergie 80 -90 80 - 90
alergie na latex 80 - 90 téměř 100
alergie na hmyzí jedy téměř 100 100
lékové alergie 50 - 64 100
Shrnutí
 spolehlivá metoda k diagnostice různých alergií
 inhalační alergeny
 potravinové alergeny
 alergie na latex
 alergie na hmyzí jed
 lékové alergie
 doplňkové vyšetření ke kožním testům a stanovení specifických
IgE protilátek
 při stanovení problematických alergenů
 aktivační znaky CD63 a CD203c
 CD63 – na aktivovaných bazofilech
 CD203c – přítomen u klidových bazofilů, zvýšení exprese během
aktivace
Ebo a kol., 2006; Ebo a kol., 2008, Wolanczyk-Medrala a kol., 2009
Zdroje:
 BIDAD, K., M. C. NAWIJN, A. J. M. VAN OOSTERHOUT, S. VAN DER HEIDE a Joanne N. G. OUDE ELBERINK. 2014.
Basophil activation test in the diagnosis and monitoring of mastocytosis patients with wasp venom allergy on
immunotherapy. Cytometry part B (Clinical cytometry). : 183-190. DOI: 10.1002/cyto.b.21148. ISBN
10.1002/cyto.b.21148. Dostupné také z: http://doi.wiley.com/10.1002/cyto.b.21148
 BOUMIZA, R., A.-L. DEBARD a G. MONNERET. 2005. The basophil activation test by flow cytometry: recent
developments in clinical studies, standardization and emerging perspectives. Clinical and Molecular Allergy. 3(9): 1-
8. DOI: 10.1186/1476-7961-3-9. ISSN 14767961. Dostupné také z:
http://www.clinicalmolecularallergy.com/content/3/1/9
 BOVENZI, D., A. GIORDANO, D. GRAZIANO, E. ASSENTATO, G. DE SIMONE, G. SPADARO a C. LO PARDO. 2011.
CD63 expression as marker of basophil activation test. In: ASSENTATO, E. a G. SPADARO. Abstracts from the XXIX
Conferenza Nazionale di Citometria. 79A. Cytometry part A, s. 1025-1077. DOI: 10.1002/cyto.a.21155. ISBN
10.1002/cyto.a.21155. Dostupné také z: http://doi.wiley.com/10.1002/cyto.a.21155
 DE WECK, A. L., M. L. SANZ, P. M. GAMBOA, W. ABERER, J. BIENVENU, M. BLANCA, P. DEMOLY, D. G. EBO, L.
MAYORGA, et al. 2008. Diagnostic Tests Based on Human Basophils: More Potentials and Perspectives than Pitfalls.
International archives of Allergy and Immunology. 18(3): 177-189. DOI: 10.1159/000115885. ISBN
10.1159/000115885. Dostupné také z: http://www.karger.com/doi/10.1159/000115885
 EBERLEIN-KÖNIG, B., C. SCHMIDT-LEIDESCHER, J. RAKOSKI, H. BEHRENDT a J. RING. 2006. In vitro basophil
activation using CD63 expression in patients with bee and wasp venom allergy. The Journal of Investigational
Allergology and Clinical Immunology. 16(1): 5-10.
 EBO, D. G., C. H. BRIDTS, M. M. HAGENDORENS, N. E. AERTS, L. S. DE CLERCK a W. J. STEVENS. 2008. Basophil
activation test by flow cytometry: Present and future applications in allergology. Cytometry part B (Clinical
Cytometry). (4): 201-210. DOI: 10.1002/cyto.b.20419. ISBN 10.1002/cyto.b.20419. Dostupné také z:
http://doi.wiley.com/10.1002/cyto.b.20419
Zdroje:
 EBO, D. G., J. SAINTE-LAUDY, C. H. BRIDTS, C. H. MERTENS, M. M. HAGENDORENS, A. J. SCHUERWEGH, L. S. DE
CLERCK a W. J. STEVENS. 2006. Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.
Allergy. 61(9): 1028-1039. DOI: 10.1111/j.1398-9995.2006.01039.x. ISSN 0105-4538. Dostupné také z:
http://doi.wiley.com/10.1111/j.1398-9995.2006.01039.x
 HAVRANOVÁ, M., I. ŠTĚTINOVÁ a S. HONZOVÁ. 2006. Měření aktivace bazofilů - CD63 nebo CD203c? Alergie.
8(1): 11-15.
 HENNERSDORF, F., S. FLORIAN, A. JAKOB, K. BAUMGÄRTNER, K. SONNECK, A. NORDHEIM, T. BIEDERMANN, P.
VALENT a H.-J. BÜHRING. 2005. Identification of CD13, CD107a, and CD164 as novel basophil-activation
markers and dissection of two response patterns in time kinetics of IgE-dependent upregulation. Cell Research.
15(5): 325-335.
 HONZOVÁ, S. 2009. Možnosti laboratorní diagnostiky. Interní medicína. 11(1): 168-170.
 HONZOVÁ, S. a M. HAVRANOVÁ. 2003. Test aktivace bazofilů, jeho přínos pro klinickou praxi. Alergie. 5: 292-
297.
 HOŘEJŠÍ, V. a J. BARTŮŇKOVÁ. 2009. Základy imunologie. 4. Praha: Triton. ISBN 978-80-7387-280-9.
 KREJSEK, J. a O. KREJSEK. 2004. Klinická imunologie. 1. Hradec Králové: Nucleus. ISBN 808622550X.
 LITZMAN, J., T. FREIBERGER, V. KRÁL a V. THON. 2009. Základy vyšetření v klinické imunologii. 1. Brno:
Masarykova univerzita. ISBN 9788021042278.
 MANDY, F. F., M. BERGERON a T MINKUS. 1995. Principles of flow cytometry. Transfusion Science. Elsevier
Science, 16(4): 303-314.
 PICHLER, W. J. 2007. Drug Hypersensitivity: In vitro Tests: Basophil Activation Tests. Basel: Karger. : 391-402.
Zdroje:
 SABATINI, F., A. USAI, L. PETECCHIA, A. DI STEFANO a F.L.M RICCIARDOLO. 2009. Allergen-induced bradykinin
B2R expression in mild atopic asthma. In: PETECCHIA, L. a F.L.M RICCIARDOLO. Abstracts from the Proceedings of
the XXVII National Conference of Cytometry. 77A. Cytometry Part A, s. 144-202. DOI: 10.1002/cyto.a.20826.
ISBN 10.1002/cyto.a.20826. Dostupné také z: http://doi.wiley.com/10.1002/cyto.a.20826
 SAINTE-LAUDY, J., A. BOUMEDIENE, F. TOURAINE, I. ORSEL, C. BRIANCHON, F. BONNAUD a M. COGNÉ. 2007.
Use of both CD63 up regulation and IgE down regulation for the flow cytometric analysis of allergen induced
basophil activation. Definition of an activation index. Inflammation Research. 56(7): 291-296. DOI:
10.1007/s00011-007-7014-5. ISBN 10.1007/s00011-007-7014-5. Dostupné také z:
http://link.springer.com/10.1007/s00011-007-7014-5
 ŠPIČÁK, V. a P. PANZNER. 2004. Alergologie. 1. vyd. Praha: Galén, xxii, 348 s. ISBN 80-726-2265-X.
 VALENT, P., A. W. HAUSWIRTH, S. NATTER, W. R. SPERR, H. J. BÜHRING a R. VALENTA. 2004. Assays for
measuring in vitro basophil activation induced by recombinant allergens. Methods. 32(3): 265-270. DOI:
10.1016/j.ymeth.2003.08.006. ISBN 10.1016/j.ymeth.2003.08.006. Dostupné také z:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1046202303002408
 WOLANCZYK-MEDRALA, A., G. GOGOLEWSKI, J. LIEBHART, K. GOMULKA, M. LITWA, P. PANASZEK, K. LINDNER
a W. MEDRALA. 2009. A new variant of the basophil activation test for allergen-induced basophil CD63
upregulation. The effect of cetirizine. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 19(6): 465-
473.
 WOLANCZYK-MEDRALA, A., G. GOGOLEWSKI, J. LIEBHART, K. GOMULKA, M. LITWA, B. PANASZEK, K. LINDNER
a W. MEDRALA. 2009. A New Variant of the Basophil Activation Test for Allergen-Induced Basophil CD63
Upregulation. The Effect of Cetirizine. Journal of Investigational Allergology and Clinical Immunology. 19(6): 465-
473.
Děkuji za pozornost!