CVIČENÍ Z ANALYTICKÉ CYTOMETRIE 2015/2016 6. – 8. 1. 2016, BFÚ Vyučující: Mgr. Karel Souček, Ph.D.; Mgr. Šárka Šimečková; PhamDr. Ján Remšík Skupina A 1. Deván, Ján (učo 423129); PřF B-EXB BIMG [sem 5, roč 3] 2. Fedorová, Veronika (učo 436702); PřF B-EXB BIMG [sem 3, roč 2] 3. Chochola, Václav (učo 423006); PřF B-EXB BIMG [sem 5, roč 3] 4. Lešundák, Pavol (učo 393768); PřF N-EXB SPBI (EBZI) [sem 3, roč 2] 5. Moudrá, Jana (učo 399998); PřF N-EXB SPBI (EBZI) [sem 1, roč 1] Skupina B 6. Řičánková, Nikola (učo 409172); PřF N-EXB SPBI (EBZI) [sem 1, roč 1] 7. Skříčková, Lucie (učo 408495); PřF N-EXB SPBI (EBZI) [sem 1, roč 1] 8. Švejdová, Barbora (učo 408224); PřF N-EXB SPBI (EBZI) [sem 1, roč 1] 9. Vilášková, Kateřina (učo 408700); PřF N-EXB SPBI (EBZI) [sem 1, roč 1] 10. Zvalo, Marek (učo 375608); PřF D-BI4 FYZZ [sem 1, roč 1] Den 1 A) B) 9 - 14 hod Úvod Hela 8 Fucci cells - analýza na průtokovém cytometru a CM MLN-4924 treatment 14- 18 hod Úvod Hela 8 Fucci cells - analýza na průtokovém cytometru MLN-4924 treatment Den 2 A) B) 9 - 12 Sběr a fixace buněk pro analýzu BC a ROS Analýza na průtokovém cytometru 12-15 Hela 8 Fucci cells - analýza na CM Sběr a fixace buněk pro analýzu BC a ROS Analýza na průtokovém cytometru 14-18 Den 3 A) B) 9 - 13.30 Sběr buněk, Imunofenotypizace, analýza na průtokovém cytometru 13. 30 - 18 Sběr buněk, Imunofenotypizace, analýza na průtokovém cytometru Protokol 1 Fucci 8 buňky - sběr, měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenčních proteinů, analýza na CM Protokol 2 Detekce ROS, buněčného cyklu a buněčné životnosti po ovlivnění buněk HCT-116 inhibitorem neddylace a menadionem Protokol 3 Značení povrchových molekul EpCAM/CD44, viability u buněk Protokol 1 Model HeLa 8 Fucci cells – měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenčních proteinů Cíl - cílem experimentu je seznámit se s modelovou buněčnou linií HeLa 8 Fucci, která umožňuje analýzu buněčného cyklu na živých buňkách bez potřeby fixace a značení - tento experiment bude demonstrační – bude Vám názorně předvedeno, jak se zpracovávají buňky pro tento typ analýzy, což využijete při přípravě dalších experimentů během tohoto cvičení - demonstrace měření proběhne na přístroji Attune® Flow Cytometer - ukázka vyhodnocení dat bude provedena pomocí programu FlowJo - analýza buněk na konfokálním mikroskopu po ovlivnění různými látkami Teorie Buněčná linie HeLa 8 Fucci - buněčná linie HeLa – lidská permanentní buněčná linie odvozená z karcinomu děložního čípku - nejstarší a jedna z nejčastěji používaných lidských buněčných linií - Fucci próba (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) – umožňuje vizualizovat progresi buněčného cyklu u živých buněk - buňky s Fucci ve fázi G1 emitují červené světlo, ve fázi S/G2/M zelené světlo - více – viz pdf. souboru uložené ve studijních materiálech (Sakaue-Sawano et al., 2008; viz studijní materiály) 1) ANALÝZA NA PRŮTOKOVÉM CYTOMETRU Materiál - připravená buněčná line HeLa 8 Fucci - roztok PBS+EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová). EDTA je chelatační činidlo, které mimo jiné vychytává Ca^2+ ionty, čímž rozrušuje mezibuněčné spoje - trypsin - pankreatický enzym (serinová proteáza), štěpí amidové a esterové vazby argininu a lysinu. Působení trypsinu uvolňuje adherentní buňky od kultivačního povrchu - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - PBS – oplach buněčné suspenze Postup: Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – 1-2 minuty nechat působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 1-2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - misku opláchnout 1 ml PBS, přenést do zkumavky k buněčné suspenzi - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 1 ml PBS - stočit 200g 5 min - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 300 ml PBS a měřit Výsledky Popište postup měření buněčného cyklu u této linie + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo 2) ANALÝZA NA KONFOKÁLNÍM MIKROSKOPU Postup: den 1: Výsev buněk HeLa 8 Fucci na mikroskopickou analýzu den 2: Ovlivnění látkami MLN-4924 (zásobní koncentrace 10 mM, výsledná koncentrace 1 µM) TRAIL (100 ug/ml zásobní koncentrace, 50 ng/ml výsledná koncentrace) Mitomycin (zásobní koncentrace 1 mg/ml, výsledná koncentrace 1 µg/ml) Doplňte poznámky k látkám TRAIL a Mitomycin (co to je za látky, co způsobují a k čemu se používají), viz poznámky u MLN-4924 v protokolu č. 2 Dopočtěte množství látek, které se bude k buňkám přidávat den 2-3: Analýza buněk na mikroskopu Popište postup analýzy na mikroskopu a změny, které jste pozorovali u buněk ovlivněných látkami. Protokol 2 Detekce ROS, buněčného cyklu a buněčné životnosti po ovlivnění buněk HCT-116 inhibitorem neddylace Cíle - cílem experimentu 1 je ovlivnit buněčnou linii HCT-116 inhibitorem neddylace (MLN-4924) a vyšetřit účinky jeho působení - působení MLN-4924 po dobu 24 hodin vede k deregulaci buněčného cyklu - cílem experimentu 2 je indukovat produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) menadionem - měření proběhne na přístroji Attune® Flow Cytometer Teorie Buněčná linie HCT-116 - buněčná linie odvozená z karcinomu tlustého střeva 1762 http://www.lgcstandards-atcc.org/~/media/Attachments/6/C/D/4/1762.ashx MLN-4924 * ATP kompetitivní inhibitor * I. fáze klinického testování pro lymfom, mnohočetný myelom, AML, ALL, melanom a další nehematologické nádory * Tvoří velmi stabilní adukt mezi NEDD8 a MLN-4924 vede k zastavení dráhy neddylace (viz obrázek). Dráha nedylace je nezbytná pro aktivitu ubikvitin ligázy Skp2^SCF, která se účastní regulace různých buněčných pochodů. Mezi její významné substráty patří proteiny řídící procesy, jako jsou buněčný cyklus (p27^Kip1, p21^cip1), buněčné replikace (Cdt1) a další. Struktura inhibitoru MLN-4924 (Soucy et al., 2009) Působení inhibitoru MLN-4924 na zastavení dráhy neddylace (Soucy et al., 2010) Reaktivní formy kyslíku (ROS) * http://www.rndsystems.com/resources/images/5267.gif R&D Systems Logo buňka generuje ROS v mitochondriích jako vedlejší produkt metabolizmu kyslíku během oxidativní fosforylace. Takto produkované radikály hrají důležité úlohy v buněčné signalizaci a udržování homeostázy (indukce exprese proapoptotických proteinů příp. indukce ochranných mechanizmů, aktivace transportních systémů pro ionty,...) * v případe nerovnováhy mezi tvorbou a vychytávaním ROS antioxidanty dochází k indukci oxidativního stersu, což vede k poškození DNA, peroxidaci lipidů a inaktivaci kofaktorů některých enzymů; oxidativní stres je možné indukovat UV zářením, ionizujícím zářením, tepelným šokem, inhibicí buněčného cyklu, hypoxií, nedostatkem séra v kultivačním médiu, syntetickými sloučeninami, např. menadionem * CellROX Green (Invitrogen) je fluorogenní próba v redukovaném stavu, určená na detekci produkcie ROS v živých buňkách; působením ROS se kvantitativně oxiduje na fluorochrom emitující zelené svetlo a váže se na DNA, v tomto případě tedy detekujeme tvorbu ROS v mitochondriích a v jádře. Detekce produkce ROS kitem CellROX Green pod fluorescenčním mikroskopem po vyvolání oxidativního stresu přidáním 100 uM menadiónu (buněčná linie U2-OS, Invitrogen). Menadion Menadion je syntetický analog vitamínu K (vitamín K[3]), chinonové struktury. Chinony jsou v buňce metabolizované mikrozomální NADPH-cytochrom P450 reduktázou a mitochondriální NADH-ubichinon oxidoreduktázou jednoelektronovými redukcemi na nestabilní semichinony, které v přítomnosti molekulárního kyslíku vstupují do redoxního cyklu a zpětně se oxidují na stabilní chinon za tvorby ROS. 1) OVLIVNĚNÍ BUNĚK INHIBITOREM MLN-4924 Materiál - zásobní roztok MLN-4924 o koncentraci 1 mM rozpuštěný v DMSO - sterilní DMSO - sterilní špičky, pipety pro práci v laminárním boxu - připravené 2 misky 60 mm s buněčnou linií HCT-116, (objem média 5 ml - důležité pro výpočet) - miska 1 – kontrola – ovlivněná pouze rozpouštědem (DMSO) – přidá se ve stejném poměru jako MLN-4924 - miska 2 – ovlivnění MLN-4924 – výsledná koncentrace 0,04 mM Výpočet - Nejprve se připraví 100 µM zásobní roztok inhibitoru MLN-4924, který se použije na ovlivnění buněk (ředění 100x v kultivačním médiu) - výsledná koncentrace inhibitoru na misce: 0,04 µM, objem média na misce: 5 ml - Dopočítejte, jaký objem zásobního roztoku MLN-4924 a DMSO budete přidávat: Práce probíhá sterilně v laminárním boxu, každý student pracuje se dvěma vzorky (kontrola, ovlivnění MLN-4924) Postup - v laminárním boxu připravit sterilní špičky, pipety a zásobní roztoky DMSO a MLN-4924 - přeneste buňky z CO[2] inkubátoru do laminárního boxu - do misky 1 přidat vypočítaný objem sterilního DMSO - do misky 2 přidat vypočítaný objem zásobního roztoku MLN-4924 - médium v miskách opatrně a jemně promíchat - misky s buňkami po ovlivnění uložit zpět do CO[2] inkubátoru - inkubace 24 hodin Po příslušné době inkubace bude následovat nesterilní odběr vzorků, značení buněk na buněčného cyklu a životnosti buněk 2) MĚŘENÍ PRODUKCE ROS A BUNĚČNÉHO CYKLU Materiál - buněčná linie HCT-116 (kontrola a ovlivněné buňky) - roztok PBS+EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová). - trypsin - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - PBS – oplach buněčné suspenze - CellROX Green kit - FxCycle Violet - Live Dead Yellow kit - nesterilní FACS zkumavky, špičky, pipety - nesterilní roztok 1% BSA – před začátkem odběru připravit 10 ml 1% BSA ředěného v PBS připraveného zředěním 20% zásobního roztoku BSA Postup 1.1. Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – 1-2 minuty nechat působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 1-2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - misku opláchnout 1 ml PBS, přenést do zkumavky k buněčné suspenzi - stočit 200g 5 minut, odsát supernatant 1.2. Detekce ROS a značení viability - Přichystat barvicí roztok s CellROX Green (výsledná koncentrace 5 μM, zásobní koncentrace 2,5 mM). Životnost buněk určíme pomocí propidium iodidu, který se ředí v PBS v poměru 1:100. Dopočtěte, kolik CellROX Green je potřeba přidat do 100 μl PBS: je potřeba přidat μl CellROX - pelet rozsuspendovat ve 100 µl PBS s rozpusteným CellROX Green - inkubovat 30 min, 37 °C - oplach PBS, stočit 200g 5 minut 1.3. Indukce produkce ROS - významného nárůstu produkce ROS dosáhneme pomocí působení menadionu (syntetický vitamín K[3]) - připravit naředěný roztok menadionu 1:10 (1 µl zásobního roztoku menadionu s koncentrací 100 mM a 9 µl PBS) - buňky rozsuspendujeme ve 100 µl PBS a přidáme 1 µl naředěného roztoku menadionu - inkubujeme 10 min, RT - přidat propidium iodid v poměru 1:100 2.1. Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – 1 min nechat působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 1-2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - misku opláchnout 1 ml PBS, přenést do zkumavky k buněčné suspenzi - stočit 200g 5 minut, odsát supernatant 2.2. Značení DNA - na měření buněčného cyklu - fixace vzorku pelet rozsuspendovat ve 100 µl 4% roztoku paraformaldehydu - inkubovat 15 min RT, oplach PBS, stočit 200g 5 minut - permeabilizace vzorku: pelet rozsuspendovat ve 100 µl 0,15% Tritonu X-100 - inkubovat 15 min, RT - oplach PBS, stočit 200g 5 minut - pelet rozsuspendovat v 300 µl FxCycle Violet v PBS (1:1000) - inkubace 30 min RT - měřit na průtokovém cytometru Výsledky Popište postup měření a vyhodnocování buněk na průtokovém cytometru + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo Protokol 3 Analýza fenotypu u buněčné linie HCT-116 Cíl - cílem experimentu je na živých buňkách značit povrchové molekuly EpCAM a CD44 pomocí specifických primárních protilátek konjugovaných s fluorescenčními značkami - je důležité detekovat expresi těchto povrchových molekul pouze na živých buňkách, proto současně se značením těchto dvou znaků bude detekovaná i viabilita pomocí speciálního fluorescenčního kitu - celkem tedy budeme značit 3 znaky a detekovat 3 fluorescenční spektra Teorie Povrchové molekuly EpCAM a CD44 * prokázány jako charakteristické znaky nádorových kmenových buněk (NKB) mimo jiné i u adenokarcinomu tlustého střeva * NKB - subpopulace nádorových buněk, které jsou pravděpodobně zodpovědné za progresi nádorového onemocnění a tvorbu metastáz * vlastnosti podobné kmenovým buňkám – schopnost sebeobnovy a tvorby jak dalších maligních buněk, tak i nemaligních prekurzorových buněk pomalu cyklující buňky, zvýšená exprese antiapoptotických molekul a také molekul zodpovědných za multilékovou rezistenci (ABC transportéry), proto jsou rezistentní k běžně aplikované chemoterapii CD44 * povrchová molekula zapojená do procesů proliferace, diferenciace, migrace, angiogeneze a dalších * u mnoha nádorových onemocnění je zvýšená exprese CD44 spojena s horší prognózou * má několik ligandů – osteopontin, fibronectin, collagen, hyaluronate * u nádorových onemocnění prostaty je považován za marker nenádorových i nádorových kmenových buněk EpCAM § transmembránový glykoprotein § vysoce exprimován u karcinomů, kmenových a nádorových kmenových buňkách § EpCAM se podílí na buněčné adhezi, proliferaci, udržování pluripotentního stavu buněk, regulaci diferenciace,.. § popsána zvýšená exprese u některých druhů rakovin - prsu, vaječníků, prostaty.... Materiál - buněčné linie: HCT-116 - roztok PBS+EDTA - trypsin - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - PBS – oplach buněčné suspenze - nesterilní FACS zkumavky, špičky, pipety - nesterilní roztok 1% BSA – před začátkem odběru připravit 10 ml 1% BSA ředěného v PBS připraveného zředěním 20% zásobního roztoku BSA - protilátky, viz tabulka níže Dopočítejte: na přípravu 10 ml 1% BSA přidat ml 20 % BSA do ml PBS použité protilátky: protilátka fluorochrom výrobce, katalogové číslo ředění EpCAM CD44 viabilita IgG2b IgG2b Vzorky: - budou připraveny 2 vzorky: specifické značení (CD) isotypová kontrola (ISO) Postup: 1. příprava vzorků - 1x 60 mm miska HCT-116 - odsát médium - oplach 3 ml PBS+EDTA - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – inkubace 2 minuty 37^oC (suchý termostat) - přidat 2,5 ml média se sérem – inaktivace trypsinu - celou suspenzi přenést do připravených nesterilních zkumavek - misky opláchnout 1 ml PBS – přenést do příslušné zkumavky - zkumavky s buněčnou suspenzí stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 1 ml PBS s 1% BSA - každou ze zkumavek rozdělit na poloviny do dvou zkumavek určených pro měření na cytometru - do každé zkumavky přidat 1 ml 1% BSA - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant a přidat příslušné protilátky ředěné v 1% BSA 2. Značení protilátkami EpCAM a CD44 - do každého vzorku se přidá 100 ml 1% BSA s příslušnými protilátkami nebo isotypovými kontrolami Dopočítejte: 1. mikrozkumavka ISO – do 50 ml 1% BSA přidáme ml IgG ml IgG 2. mikrozkumavka specifické značení – do 50 ul 1% BSA přidáme ml CD44 ml EpCAM - do jedné zkumavky přidáme 50 ml z mikrozkumavky 1 (ISO) - do druhé zkumavky přidáme 50 ml z mikrozkumavky 2 (CD) - všechny vzorky důkladně propipetovat - inkubace 20 min v lednici - po 20 min přidat ke všem vzorkům 1 ml čistého PBS - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet ve všech mikrozkumavkách rozsuspendovat ve 100 ul PBS s naředěnou značkou pro viabilitu 3. značení na rozlišení živých a mrtvých buněk - k buňkám přidáme propidium iodid (neprojde přes buněčnou membránu živých buněk) a ihned měříme Výsledky Popište postup měření a vyhodnocování buněk na průtokovém cytometru + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo Imunofenotypová analýza