1. H. Braconnot (30. léta 19. století) - Strassburg – vinné kvasinky – izolace „matiére animale“. 2. J.F. Meischer (1868-1869) - experimenty z hnisem a mlíčím rýnského lososa – NUKLEIN 3. Altman (1899) pokračoval v experimentech svého předchůdce ( živočišné tkáně – thymus a kvasinky) – nazývá izolovanou látku – kyselina nukleová - DNA 4. Leven (1909) – izoloval z NK kyselinu fosforečnou , cukr a báze – pojmenoval další typ NK – RNA 5. Avery, MacLeod ,McCarty (1943) DNA přenáší genetickou informaci – infekční princip Avery-MacLeod-McCarty experiment – virulence DNA u Pneumococcus File:Griffith experiment.svg 1. H. Braconnot (30. léta 19. století) - Strassburg – vinné kvasinky – izolace „matiére animale“. 2. J.F. Meischer - experimenty z hnisem a mlíčím rýnského lososa – NUKLEIN 3. Altman – pokračoval v experimentech svého předchůdce ( živočišné tkáně – thymus a kvasinky) – nazývá izolovanou látku – kyselina nukleová - DNA 4. Leven (1909) – izoloval z NK kyselinu fosforečnou , cukr a báze – pojmenoval další typ NK – RNA 5. Avery, MacLeod ,McCarty (1943) DNA přenáší genetickou informaci – infekční princip 6. Watson, Crick, Wilkins,(1953) – model sekundární struktury DNA – Nobelova cena 1962 DNA (AGCT) RNA (AGCU) > - Ribozymy - biokatalyzátory Báze DNA RNA Báze -tautomerie F05-09.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: NH2 NH amin imin Všechny atomy (kromě H a NH2) leží v rovině !!!! 99,9 % 97 % Monosacharidy DNA RNA Nukleosid Kyselina fosforečná Ester Anhydrid Anhydrid Nukleotid Názvosloví Funkce nukleotidů •přenašeče energie (ATP, GTP) • •fosforylační činidla (ATP – kinasy) • •aktivátory meziproduktů biosyntéz – UDP-glukosa, CTP-cholin • •součásti kofaktorů - NAD(P), FAD, PAPS, • •využití v terapii - antivirotika(AIDS, herpes) – AZT • •stavební složky nukleových kyselin • • • Polynukleotid – nukleová kyselina unnumbered figure pg 9 Watson Crick Chargaffovy pravidla A+G=T+C A=T G=C A+C=G+T > Zastoupení basí v DNA (molární %) Organismus A T G C Člověk 30.9 29.4 19.9 19.8 Kuře 28.8 29.2 20.5 21.5 Kobylka luční 29.3 29.3 20.5 20.7 Pšenice 27.3 27.1 22.7 22.8 Kvasinky 31.3 32.9 18.7 17.1 E. coli 24.7 23.6 26.0 25.7 Chargaffovy pravidla nezávisí na tkáni nezávisí na stáří nezávisí na nutričních faktorech nezávisí na životním prostředí Jerry Donohue tautomerní formy bází Rosalind Franklin http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg2/dna2/x_difrakce.jpg http://4.bp.blogspot.com/_7ycFHfdh3bk/TLg7djIc8iI/AAAAAAAAAHY/FnAKID3jFrI/s1600/photo+51+explanatio n.jpg Obrázek 51 Nobelova cena 1962 Párování basí – H můstky F05-12.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Stabilizující vazby v DNA Stohování bází F29-14.jpg 0008F26FMacintosh HD B74677AA: Denaturace - renaturace F05-14.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Denaturace - renaturace F05-15.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: F05-16.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: B DNA F29-01a.jpg 0008F26FMacintosh HD B74677AA: A DNA F29-02a.jpg 0008F26FMacintosh HD B74677AA: Z DNA F29-03a.jpg 0008F26FMacintosh HD B74677AA: Základní číselné charakteristiky tří nejznámějších helikálních forem DNA Atribut A-DNA B-DNA Z-DNA Točivá tendence šroubovice (chiralita)[1] pravotočivá pravotočivá levotočivá Opakování[2] po každém páru po každém páru po každých dvou párech Otočení po každém opakování[1] 32,7° 34,3° Průměrný počet párů na jedno otočení šroubovice[1] 11 10,5 12 Sklon páru k ose[2] 20° 6° 7° Vzestup vůči ose na jeden pár[1] 2,55 Å (0,25 nm) 3,4 Å (0,34 nm) 3,7 Å (0,37 nm) Průměr[1] 23 Å (2,3 nm) 20 Å (2,0 nm) 18 Å (1,8 nm) Základní číselné charakteristiky tří nejznámějších helikálních forem DNA Bakteriální DNA Bakteriální DNA F29-17.jpg 0008F26FMacintosh HD B74677AA: Lidské chromozomy Jádro – mitotický chromozom 5 – 8 µm – DNA 2 metry Chromozom Chromatin Nukleosom (korálky) (cívka) (smyčka) Nukleosom – DNA + 5 tříd histonů 2 x H2A - 2 x H2B - 2 x H3 - 2 x H4 Exon a intron 5 % 95 % Exon a intron Význam intronů •v počátku evoluce genů urychlovaly vznik nových bílkovin pomocí rekombinace exonů • •možnost tzv. alternativního sestřihu, kdy může vznikat na základě vývojového stádia buňky hned několik různých typů mRNA - z jednoho genu tak může vznikat několik různých bílkovin Stanovení sekvence DNA •Restrikční enzymy • •Chemické štěpení – Maxam Gilbertovo metoda • •Enzymová metoda • •Pyrosekvenování • • • • Restrikční enzymy Restrikční enzymy F05-37.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Restrikční enzymy F05-41.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Restrikční enzymy Maxam Gilbertova metoda Maxam Gilbertova metoda Maxam Gilbertova metoda dimetylsulfát a piperidin hydrazin a piperidin kyselina a piperidin kyselina, NaCl a piperidin Maxam Gilbertova metoda RNA versus DNA tRNA miRNA - microRNA 1993 Victor Ambrose Micro RNA Centrální dogma mol.biologie Crick 1958 - cesta od NK k proteinu Centrální dogma mol.biologie F05-22.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Prokaryota Eukaryota Replikace – zdvojení - DNA→DNA F30-003.jpg 001136FCMacintosh HD B74677AA: figure 11-01 Replikace DNA Meselsonův a Stahlův experiment figure 11-02a Ultracentrifugace Preparativní ultracentrifuga optpg4_2 Rotory •Úhlový – diferenciální centrifugace • •Výkyvné – zonální centrifugace • Diferenciální centrifugace •opakovaná centrifugace se zvyšující se rychlostí otáček = gravitací • Úhlový rotor • optpg2_2 differential_f4 differential tj25_1c1 Gradientová centrifugace Hustotní bariera Diskontinuální Kontinuální Gradientová centrifugace Hustotní bariera Diskontinuální Kontinuální Výkyvný rotor • tj25_1b1 optpg2_3 density_gradient_f2 densgrad Gradientová centrifugace média •Sacharosa •Glycerol • •Ficoll - dextran •Percoll – SiO2 • •CsCl •Cs2SO4 • Hypertonické prostředí • Nutno připravit gradient Gradient vzniká během centrifugace • Gradientová centrifugace Gradientová centrifugace Gradientová centrifugace Gradientová centrifugace Diferenciální versus gradientová centrifugace 4 x 1 x Meselsonův a Stahlův experiment figure 11-02a Meselsonův a Stahlův experiment figure 11-02b Meselsonův a Stahlův experiment figure 11-02c Replikace DNA + NTP + Mg2+ + 7 enzymů Účast enzymů na replikaci table 11-02 Prokaryontní replikace figure 11-04 Prokaryontní replikace F30-028.jpg 001136FCMacintosh HD B74677AA: Replikace u E.coli Eukaryontní replikaci figure 11-05 Replikace u drosofily F30-006.jpg 001136FCMacintosh HD B74677AA: F30-001.jpg 001136FCMacintosh HD B74677AA: DNA polymeráza III 5‘® 3‘ figure 11-09 figure 11-10a figure 11-10b figure 11-10c figure 11-10d figure 11-10e figure 11-10f F05-34.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: F05-35.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Enzymová metoda figure 11-30 figure 11-29 2003 - Projekt lidského genomu Kapilární elektroforéza CZE ce-animation Hjerten 1967 1981 - Jorgenson Lukacsová Beckman 1987 P/ACE™ MDQ DNA System 2003 - Projekt lidského genomu Pyrosekvenování •První reakcí je DNA polymerace pomocí DNA polymerázy, kdy dochází k zařazení příslušného deoxynukleotid trifosfátu (dNTPs) za uvolnění pyrofosfátu. • • (DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi (polymeráza) • •Vzniklý pyrofosfát je uvolněn z polymerázy a může sloužit jako substrát pro ATP sulfurylázu. Při této reakci dojde ke kvantitativnímu převedení pyrofosfátu na ATP. • • PPi + APS → ATP + SO42- (ATP sulfuryláza) Pyrosekvenování Pyrosekvenování •První reakcí je DNA polymerace pomocí DNA polymerázy, kdy dochází k zařazení příslušného deoxynukleotid trifosfátu (dNTPs) za uvolnění pyrofosfátu. • • (DNA)n + dNTP → (DNA)n+1 + PPi (polymeráza) • •Vzniklý pyrofosfát je uvolněn z polymerázy a může sloužit jako substrát pro ATP sulfurylázu. Při této reakci dojde ke kvantitativnímu převedení pyrofosfátu na ATP. • • PPi + APS → ATP + SO42- (ATP sulfuryláza) Pyrosekvenování > Pyrosekvenování •Během třetí a čtvrté reakce je ATP převedeno na světelný signál pomocí enzymu luciferázy a následně je světelný signál detekován a vyhodnocen programem. • •Luciferáza + D-luciferin + ATP → Luciferáza-luciferin-AMP + PPi • •Luciferáza-luciferin-AMP + PPi + O2 → Luciferáza + Oxyluceferin + AMP + CO2 + světlo • Pyrosekvenování > Pyrosekvenování •Poslední enzymatickou reakcí je reakce apyrázy, která odstraní nezainkorpované nukleotidy a ATP, aby následně mohlo dojít k zopakování celého výše popsaného procesu a mohlo být analyzováno zařazení dalšího nukleotidu. Tato degradace je nezbytná, aby bylo zajištěna synchronizace mezi syntézou a detekcí světelného signálu. • •ATP→AMP + 2Pi (apyráza) • •dNTP→dNMP + 2 Pi (apyráza) Pyrosekvenování > 454 pyrosekvenování Sekvenování table 13-03 PCR Mullis NC1993 figure 13-11 part 1 File:Kary Mullis.jpg figure 13-11 part 2 PCR Mullis figure 13-11 part 3 http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/images/PCR-principe.jpg Nastartování reakce Průběh reakce Analýza produktů reakce http://img.directindustry.com/images_di/photo-g/pcr-thermal-cycler-polymerase-chain-reaction-22548- 2303833.jpg Thermocycler Real time PCR Real time PCR Real time PCR Real time PCR http://www-heliobiotec.cea.fr/images/images-techniques/qPCR.png Real time PCR proteinů Graphical abstract: The real-time PCR for sensitive protein detection by target-induced intermolecular hybridization > Real time PCR proteinů Transkripce – přepis - DNA→RNA F05-24.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: DNA + NTP + 1 enzym RNA polymeráza unnumbered figure pg337 5‘® 3‘ figure 11-22 part 1 figure 11-22 part 2 figure 11-22 part 3 F31-016.jpg 001161EFMacintosh HD B74677AA: Syntéza eukaryontní RNA figure 11-28 – – Cap F31-043.jpg 001161EFMacintosh HD B74677AA: Regulace translace F05-25.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Syntéza bílkovin F05-28.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: mRNA + ribozomy + (tRNA-AMK) + IFn + RFn Translace – překlad - RNA→protein figure 12-01 Ribozomy F32-026a.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: Ribozomy E.coli Polyribozomy Bombyx mori F32-040.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: Aktivace AMK figure 12-04 F32-013.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: figure 12-03 F32-007.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: Kodón Genetický kod •Tripletový 43= 64 • •Degenerovaný • •Nepřekrývající se • •Universální • • F05-30.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Inicializace F32-045.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: F32-041.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: Elongace F32-048.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: Terminace F32-060.jpg 001177E5Macintosh HD B74677AA: figure 12-05a figure 12-05b figure 12-05c figure 12-06 figure 12-07 figure 12-16 Posttranslační modifikace •fosforylace/defosforylace – enzymy kinázy a fosfatázy připojují či odpojují fosfátovou (PO43-) skupinu k proteinu na jeho serinové / threoninové zbytky nebo tyrosinové zbytky. Fosforylace/defosforylace často působí jako přepínač mezi aktivní a neaktivní formou proteinu. • •glykosylace – napojování sacharidů na protein. Sacharidové zbytky jsou nejčastěji připojovány na serin/ threonin – v případě tzv. O-glykoproteinů, nebo asparagin v případě N-glykoproteinů. Navázání sacharidů může stabilizovat konformaci proteinů; sacharidové složky mnoha proteinů se účastní rozpoznávacích interakcí (protein-sacharidové a nově objevené sacharid-sacharidové interakce) • • Posttranslační modifikace •ubikvitinace – připojení malého proteinu ubiquitinu k upravovanému proteinu přes aminokyselinu lysin ( její volný –NH2 konec). Připojování ubiquitinu na proteiny slouží jako molekulární hodiny, které určují stáří proteinu. Proteiny s mnoha navázanými ubiquitiny jsou degradovány v cytoplasmě pomocí proteazomu. Kromě této funkce, specifické navázání několika molekul ubiquitinu slouží k regulaci funkce některých proteinů • •sumoylace - připojení proteinu SUMO1, regulace funkce proteinů. • •proteolýza – odštěpení části molekuly proteinu – vede často k aktivaci nebo desaktivaci funkce proteinu. • • Posttranslační modifikace •acetylace – acetylace koncové –NH2 lysinu snižuje jeho bazicitu a zeslabuje tak iontové interakce • •hydroxylace – hydroxylace prolinu nebo lysinu v kolagenu, slouží ke stabilizování specifické konformace molekuly kolagenu (trojitá šroubovice). • •disulfidické můstky - oxidace dvou -SH skupiny cysteinu na -S-S- • •vazba prostetických skupin – např. FAD, FMN, hem, nutné pro funkci některých enzymů • Kontrola exprese genu table 12-04 Genetické inženýrství figure 13-08 figure 13-03 figure 13-01 figure 13-06 part 3 Rezistence k ampicilinu Rezistence k tetracyklinu Inklusní tělíska F05-55.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: Využití AC pro purifikaci rekombinantních proteinů Green Fluorescent Protein Aequorea victoria Green Fluorescent Protein NC 2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Tsien Green Fluorescent Protein GFP AMK sekvence – 238 AMK MSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICT TGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTI FYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNS HNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLP DNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYK Green Fluorescent Protein Reportérový gen Green Fluorescent Protein Green Fluorescent Protein table 13-01 F05-49.jpg 0005D4FFMacintosh HD B74677AA: table 13-02 Literatura Genetická daktyloskopie http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/PCRProcess.jpg Použití restrikčních enzymů - RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Short tandem repeats http://ej.iop.org/images/0295-5075/65/2/290/Full/img5.gif Short tandem repeats http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7a/Codis_profile.jpg Short tandem repeats Short tandem repeats http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/powerplex.gif Short tandem repeats http://science.kennesaw.edu/~rrascati/images/genescan.jpg X – 106 Y - 112 Testy paternity •Zjednodušené testy • •STR na Y chromosomu – mužských potomků srovnání s otcem • •Mitochondriální DNA – dědí se po matce – matroklinní dědičnost Mitochondriální Eva před 200 000 let v Africe Haplotyp Y-chromozomální Adam před 110 000 let v Africe DNA chipy DNA chipy DNA chipy F07-39.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Kapkování Fotolitografie DNA chipy DNA chipy - barva skvrn DNA chipy - vybavení DNA chipy software F07-40.jpg 0005D57BMacintosh HD B74677AA: Proteinové chipy C:\My Documents\upstream.jpg Proteinové chipy – typy interakcí Protilátka Antigen Ligand Detekce: SELDI MS, fluorescence, SPR, electrochemická, radioaktivity, Lecture 1.1 215 Anti-GST Probe Fig2ab Blotting Blotting Blotting •Southern – DNA • •Nothern – RNA • •Western - bílkoviny Výhody blottingu •Dostupnost biomakromolekul •Zakoncentrování biomakromolekul •Redukce doby a množství potřebných chemikálií •Imobilizace biomakromolekul – možnost uchovávání •Možnost vícenásobné detekce •Mechanická stabilita FILTRAČNÍ PAPÍR KATODA DRŽÁK FILTRAČNÍ PAPÍR NÁDOBA S PŘENOSOVÝM PUFREM DRŽÁK HOUBA HOUBA + - ANODA BLOTOVACÍ MEMBRÁNA GEL Tankový elektroblotting Tankový elektroblotting 60763 Tankový elektroblotting Mini Protean Trans Blot Cell 60855 „Semi dry“ blotting FILTRAČNÍ PAPÍR + FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA KATODA ANODA - GEL „Semi dry“ blotting 60847 Membrány Detekce DNA Proteiny Detekce DNA Detekce DNA Proteiny Detekce proteinů Izolace nukleových kyselin Cíl izolace •Odstranění proteinů • •DNA vs RNA • •izolace specifického typu NK • Typy NK •genomická (chromosomalní) • •organelová (mitochondrie, chloroplasty) • •plasmidy (extra-chromosomalní) • •virová (ds nebo ss) • •komplementární (mRNA) • Nejpoužívanější metody •na základě rozdílné rozpustnosti – extrakce, srážení • •na základě vlastností - chromatografie – polarita- adsorpční, náboj-ionexová • •sedimentace - gradientová ultracentrifugace Postup •1. Rozbití buněk a membrán pro uvolnění NK • •2. Inaktivace DNA- nebo RNA-degradujících enzymů (DNasy, RNasy). • •3. Separace NK od dalších komponent uvolněných z buňky. –Extrakce/Precipitace –Chromatografie –Ultracentrifugace • Extrakce/Precipitace Organic extraction Brown p.28 Izolace genomické DNA Typická procedura 1.Sklizení buněk 2.Lyse buněk –0.5% SDS + proteinase K (55o několik hodin) 3.Fenolová extrakce –Jemné třepání několik hodin (pH 8) 4.Ethanolová precipitace 5.Působení RNAsy a proteinasy K 6.Opakování kroku 3 a 4. Hrubý lyzát obsahující NK a další součásti buňky Smíchání vzorku s organickou fází ve stejném poměru. e.g. phenol, chloroform, or phenol:chloroform Centrifugace Vodná fáze obsahuje NK, organická fáze lipidy. Nerozpustné složky (denaturované bílkoviny přítomné v interfázi. Opakovaná extrakce pro zvýšení čistoty Použití vodné fáze Extrakce/Precipitace Krok 3: Organická extrakce Organická fáze Vodná fáze Interfáze After Přidání EtOH a soli Supernatant Pelet 70% EtOH Rozpuštění (H2O, TE, etc.) Krok 4: Precipitace NK Extrakce/Precipitace Před Po Centrifugace Promytí Centrifugace • 2-2,5 objem EtOH • -20o C • Vysoká I • pH 5-5.5 Detail kroku 5 Použití nukleas pro odstranění nechtěné DNA nebo RNA + DNase + RNase + DNase (protein) + RNase (protein) Chromatografie Adsorpční chromatografie Krok 1: Příprava lyzátu Silica-gel membrána Aplikace na kolonku Krok 2: Adsorpce na silikagel Adsorpční chromatografie Centrifugace Odpad NK Extrakční pufr pro vazbu DNA a RNA na silikagel: • nízké pH • vysoká iontová síla • chaotropní soli Adsorpční chromatografie Centrifugace NK Krok 3: Vymytí kontaminant Promývací pufr NK Odpad NK Eluční pufr Eluční pufr: Vysoké pH Nízká iontová síla Krok 4: Eluce NK Centrifugace NK Ionexová chromatografie Eluce zvýšením pH nebo vysokou I Ionexová chromatografie Vazba při nízkém pH nízké I Separation of Nucleic Acids by CeCl Gradient Centrifugation cesium_chloride Plasmid DNA Brown p.44 Izolace RNA - speciální přístupy •nutno použít inhibitory RNAsy • •extrakce guanidium chloridem • •fenolová extrakce při pH < 4 (pH 8 pro DNA) • •působení RNase-free Dnase •selektivní precipitace rRNA, mRNA s LiCl • •oligo-dT afinitní chromatografie - mRNA Kontrola čistoty a kvantifikace NK Kontrola NK •spektrofotometricky •kvalita •kvantita •gelová elektroforéza •kvalita A 260 1.0 » 50 m g/mlds » 33 µg/mlss DNA A 260 /A 280 1.6 - 1.8 A 260 1.0 » 40 m g/ml RNA A 260 /A 280 ~2.0 genomická DNA DNA (degradovaná) Kontrola degradace: DNA Kontrola degradace: RNA 25S 18S