> F15-07.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: konstitutivní inducibilní bez vedlejších produktů Bio- versus katalyzátory •Vyšší reakční rychlostí • •Mírnější podmínky • •Vyšší specifita – typ reakce a typ substrátu • •Schopnost regulace Citlivost vůči řadě vlivů a menší stabilita Biokatalyzátory •Globulární bílkoviny – enzymy • •RNA – ribozymy Cech Altmann NC1986 • Enzymy – molekulární stroje • 2 H2O2 O2 + 2H2O • •Rychlostní konstanta : ØBez katalýzy - 0,23 s-1 ØPt - 1,3 . 103 s-1 ØEnzym - katalasa - 3,7 . 107 s-1 Enzymy – molekulární stroje figure 5-01 0 Pt Katalasa Enzymy – molekulární stroje •Katalasa • •2 H2O2 O2 + 2H2O • •Číslo přeměny 40 000 000 • • • • 1 molekula enzymu přemění 40 000 000 molekul substrátu za 1 s File:PDB 7cat EBI.jpg Synthasy Syntethasy table 5-2 part 1 table 5-2 part 2 Typy reakcí •jednoduché •Katalasa •složité •DNA polymerasa http://www.brenda-enzymes.info/ Enzyme Database - BRENDA - Windows Internet Explorer Escherichia coli Homo sapiens 3 000 bílkovin 25 000 bílkovin 101_0198 Enzymy – stanovení koncentrace e Koncentrace ↔ Katalytická aktivita Substrát « Produkt nBiochemie nMolekulární biologie n nKlinická diagnostika nFarmakologie – vývoj léčiv nBiotechnologické procesy nBioanalytická chemie Stanovení aktivity enzymů Metody používané pro stanovení aktivity enzymů •Spektrofotometrické •Spektrofluorimetrické •Elektrochemické •Radiochemické •Separační – HPLC, GC, CE • Enzyme Assays R.Eisenthal and M.J. Danson C:\Documents and Settings\arcturus\Dokumenty\Piešťany\0978019963820_500X500.jpg HPLC in Enzymatic Analysis E.F. Rossomando http://media.wiley.com/product_data/coverImage300/03/04711034/0471103403.jpg mikrokatal (μkat) = 10-6 kat nanokatal (nkat) = 10-9 kat pikokatal (pkat) = 10-12 kat 1 IU = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat 60 % table 6-2 ADH LDH table 6-1 part 1 Kyselina nikotinová B3 table 6-1 part 2 table 6-1 part 3 table 6-1 part 4 Katalytická část Vazebná část Vazebná část H- Warburgův optický test •Přímé stanovení • • •Pomocná reakce • • Katalytická část Vazebná část Katalytická část Vazebná část FAD (FMN) « FADH2 (FMNH2) FAD (FMN) « FADH.« FADH2 (FMNH2) Warburgův optický test -CH2OH -CHO Katalytická triáda „Lock and key“ model figure 5-09 figure 5-10 „Induced fit“ model „Transition state“ model figure 5-11 Aktivní místo •Efekt přiblížení – překryv orbitalů •Specifické mikroprostředí – pH, I, hydrofobita atd •Dehydratace •Koncentrační efekt - 105 •Vhodná orientace • • Proximitní a orientační http://www.web.virginia.edu/Heidi/chapter16/Images/8883n16_15.jpg INTERMOLEKULÁRNÍ REAKCE INTRAMOLEKULÁRNÍ REAKCE Aktivační energie • • • •Uvolněna při vazbě substrátu na enzym Mechanismus katalýzy •Acidobazická – Asp, Glu, His, Lys, Arg, • Cys, Ser, Tyr • •Kovalentní – Ser, kofaktory • •Kovovými ionty Acidobazická kyselé proteázy figure 5-12 Kovalentní serinové proteázy unnumbered figure pg 150 Kovovými ionty figure 5-13a Kovovými ionty figure 5-13b figure 5-13c F15-09.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: Lysozym + F15-08.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: Lysozym F15-10a.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: F15-12.jpg 00062800Macintosh HD B74677AA: Lysozym lysozyme pH 5,5 F13-01.jpg 000627D2Macintosh HD B74677AA: F13-03.jpg 000627D2Macintosh HD B74677AA: figure 5-05 http://www.bioinfo.org.cn/book/biochemistry/chapt08/212-2.jpg > figure 5-04 Ustálený stav E + S ES ↔ EP E + P F14-07.jpg 000627DBMacintosh HD B74677AA: Odvození rovnice Michaelis Mentenové k1 k2 E + S <===> ES ===> P + E k-1 k1 [E][S] = k-1 [ES] + k2 [ES] [E]tot = [E] + [ES] [E] = [E]tot - [ES] k1 ([E]tot - [ES])[S] = k-1 [ES] + k2 [ES] ([E]tot - [ES])[S] = (k-1 + k2/ k1) [ES] Km= (k-1 + k2/ k1) ([E]tot - [ES])[S] = Km [ES] [E]tot [S] - [ES][S] = Km [ES] 1.Předpoklad – koncentrace [ES] se v ustáleném, stavu nemění [E]tot [S] = Km [ES] + [ES][S] [E]tot [S] = [ES] (Km + [S]) [ES] = [E]tot [S] /(Km + [S]) v1 = v-1 + v Odvození rovnice Michaelis Mentenové k1 k2 E + S <===> ES ===> P + E k-1 [ES] = v0/k2 Vmax= k2 [E]tot 2.Předpoklad – tvorba produktu je přímo úměrná koncentraci [ES] [ES] = [E]tot [S] /(Km + [S]) v0/k2 = [E]tot [S] /(Km + [S]) v0= k2 [E]tot [S] /(Km + [S]) v0= Vmax [S] /(Km + [S]) vo = Vmax [S] Km + [S] [S] = nízká → vysoká Reakce 0 řádu Reakce1 řádu Stanovení Km a Vmax figure 5-03 unnumbered figure pg 142 table 5-3 table 5-4 Km ?? •Taková koncentrace substrátu, že reakce poběží polovinou Vmax • •Je mírou afinity substrátu k enzymu • •Nezávisí na koncentraci enzymu, závisí na prostředí T, I, pH, efektory atd. • Proč Km ?? •Přibližná hodnota intracelulární koncentrace substrátu •Substrát s nižší hodnotou Km je pravděpodobně fyziologický •Hodnotu lze ovlivňovat – možnost regulace •Srovnání enzymů •Stanovení enzymové aktivity fosforyláza kreatinkináza Laktáthydrogenáza A – NADH, B – Pyr) Transaminázy A-AMK, B-OxoK Alkoholdehydrogenáza A – NAD+, B – EtOH) Transaminázy A-AMK, B-OxoK http://www.web.virginia.edu/Heidi/chapter14/Images/8883n14_20.jpg http://www.web.virginia.edu/Heidi/chapter14/Images/8883n14_19.jpg Sekvenční Ping-pongový figure 5-06 figure 5-07 Inaktivace Ser diisopropylfosfofluoridem (DIPF) figure 5-15b Inhibice SDH malátem Malonic Inhibition figure 5-15c figure 5-15d Akompetetivní inhibice table 5-5 figure 5-18 Regulace koncentrací enzymu Operonový model Allosterie allosteric2 Allosterie allosteric Allosterie allosteric Allosterický aktivátor an-allo-activator Allosterický inhibitor an-allo-inhibitor Symetrický model figure 6-05 Sekvenční model figure 6-06 Allosterie hemoglobinu Myoglobin Hem Vazba O2 na Hb Vazba O2 na Hb Hb versus Mb Solné můstky Solné můstky Solné můstky Bohrův effekt – vliv H+ a CO2 Bohrův effekt – vliv H+ a CO2 Bohrův effekt – vliv H+ a CO2 Bohrův effekt – vliv H+ a CO2 pro05-04 Vliv BPG Vliv BPG a nadmořská výška Vliv BPG a nadmořská výška Fetální versus normální Hb Fetální versus normální Hb Regulace kovalentní modifikací glykogenfosforylasa P P P P Regulace kovalentní modifikací glykogenfosforylasa figure 6-07 Regulace kovalentní modifikací figure 6-08 Regulace kovalentní modifikací Regulace zpětnou vazbou Regulace Umělé enzymy Úprava přírodních enzymů http://www.hplc.cz/Chiral/Chrom/Cyclodextrins.png Klotz, Scarpa - 1971 Abzymy figure 6-11 Schultz, Lerner - 1986 Ribozymy – katalytická RNA 1989 Nobelova cena • •Altman (Yale University) ribonukleasa P • •Cech (University of Colorado) mRNA http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b3/Thomas_r._cech.jpg http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1989/altman_postcard.jpg Ribonukleasa P (Altman) figure 6-12 Autokatalytická mRNA (Cech) Tetrahymena thermophila figure 6-13 DNAzymy (1994) • •Ronald R. Breaker (Yale University) •Štěpení RNA v přítomnosti Pb2+ DNAzymy • •Katalyzují např. : –DNA fospforylaci –DNA adenylaci –DNA deglykosylaci –DNA štěpení – 10-23 DNAzym 10-23 DNAzym 10-23 DNAzym Využití enzymů •Celé buňky • •Extrakty z buněk • •Enzymy volné versus imobilizované Volné versus imobilizované enzymy Stabilita enzymů vzrůstá v imobilizovaném stavu Imobilizované enzymy mohou být používány opakovaně ® pokles nákladů Produkt reakce není kontaminován enzymem ® odpadá potřeba purifikace Imobilizované enzymy mohou být použity v kontinuálních procesech Výhody imobilizovaných enzymů Využití enzymů – celé buňky •Nejstarší metody •Potravinářství –Výroba sýrů a jogurtů (Lactobacillus) –Výroba piva a vína (Saccharomyces cerevisiae) –Výroba octa (Saccharomyces cerevisiae) •Chemické výroby –Výroba kyseliny citronové (Aspergillus niger) –Výroba antibiotik (plísně) –Výroba vitaminů, steroidů a aminokyselin •Těžké technologie –Čištění odpadních vod –Zpracování rud • Rhodanasa (EC 2.8.1.1) CN- + S2O32- ® SCN- + SO32- Homo sapiens Detoxikace kyanidu - otravy - cigaretový kouř - glykosinoláty Brassicacceae Acidithiobacillus ferrooxidans Biohydrometalurgie Životní prostředí thiobacil Využití enzymů – isolované enzymy •Široká paleta enzymových preparátů • •Invertasa – výroba invertovaného cukru •Proteasy, lipasy – prací prostředky •DNA-polymerasy, restrikční endonukleasy, ligasy – genové technologie • b-galaktosidasa – odstraňování laktosy z mléka • •Další možná využití: –chemické synthesy Organické syntézy •+ - specifita (stereospecifita) • - neextrémní podmínky (ekonomika, ŽP) • •- - malá stabilita • - nevodná prostředí • - omezená dostupnost (cena) • - regenerace Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Proteolytické enzymy •Biodetergenty (termostabilní, alkalické bakteriální proteasy) •Mlékárenský průmysl (chymosin z telecích žaludků à specifická proteolýza kapa-kaseinu à tvorba sýřeniny) •Krmivářský průmysl à výroba technických hydrolyzátů bílkovin •Masný průmysl à tenderizace (změkčení) masa (rostlinná proteasa papain) •Pivovarnictví à enzymové stabilizátory piva (odstraňování chladových zákalů) • • Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Amylasy •α-amylasy à hydrolýza 1,4-α-glukosidických vazeb uvnitř polysacharidové molekuly •Ztekucování škrobu (nezbytné při následné výrobě glukosových syrupů a glukosy) •Součást biodetergentů (odstraňování škrobového pojidla z textilních vláken) Nejvýznamnější technické aplikace enzymů (glykosidasy) •β-amylasy à odštěpují maltosové jednotky z neredukujícího konce polysacharidového řetězce •Glukoamylasa à odštěpuje glukosové jednotky od neredukujícího konce (zpracování škrobu na škrobové sirupy; odbourávání zbytkových dextrinů v pivu à vyšší stupeň prokvašení, diabetické pivo) •Invertasa à hydrolýza sacharosy na glukosu a fruktosu, výroba invertního cukru •β-galaktosidasa à hydrolýza laktosy na glukosu a galaktosu (výroba delaktosovaného mléka, mléko pro výrobu zmrzliny (zabránění krystalizace laktosy) • Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Glukosaisomerasa (xylosaisomerasa) •Isomerace glukosy na fruktosu •Výroba fruktosových sirupů (42 % - 55 % fruktosy) z glukosových sirupů (zejména z kukuřičných a obilních škrobů) à vyšší sladivost Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Celulasy •Komplexní enzymový systém katalyzující hydrolýzu celulosy •Celulasa z Trichoderma viridae à odbourání nativní celulosy •Zpracování celulosové suroviny (dřevěné odpady, odpadní papír) •Výroba instatních potravin (káva, čaj), digestiva v krmných směsích, zvýšení účinnosti extrakce šťav z rostlinných materiálů Nejvýznamnější technické aplikace enzymů •Lipasy •Biodetergenty •Ovlivnění chuti a vůně potravinářských výrobků (sýrařství !!!) •Součást digestivních přípravků Příklady lékařských aplikací enzymů •Fibrinolýza (cílené rozpouštění krevních sraženin) à plasmin, streptokinasa, urokinasa (aktivátory plasminogenu) •Cílená tvorba krevních sraženin à thrombin •Trávicí enzymy •Trypsin à čištění ran od hnisu •Lysozym à oční kapky • Enzymy jako analytická čidla •Specifita – reagují pouze s daným substrátem • •Citlivost • •Analýza nepřečištěným vzorků – tělní tekutiny Analytická biochemie •Stanovení substrátů • •Stanovení inhibitorů • •Stanovení aktivity enzymů End-point versus kinetické stanovení 0 čas A inkubace [S] n[S] A ® P > Reakce v roztoku kreatinkinasa •Přímé stanovení • • •Pomocná reakce •Kreatin-P + ADP Kreatin + ATP • > Izoenzymy LHD Automatické analyzátory Zvyšující se množství glukosy žádná glukosa Diagnostické proužky Biosenzory Amperometrické biosenzory Leland C. Clark Jr. 1956 File:Dr. Leland C. Clark Jr 2005.jpg LED Glucose oxidase oxiduje glukozu za uvolnění elektronů – které jsou detekovány převodníkem A převedeny na elektrický proud Transducer Amplifier Generovaný proud je proporcionální množství glukózy znázorněnému na display Glukoza V krvi Glukoza oxidáze Biosensor na glukosu Konduktometrické biosenzory Potenciometrické biosenzory ELISA http://exploreable.files.wordpress.com/2011/05/ch4f35.jpg ELISA – stanovení antigenu ELISA – stanovení protilátky negativní pozitivní ELISA - vybavení Absorbance Microplate Reader: ELx800 sc-204464 http://www.labmark.cz/image.php?file=xplorer_8ch.jpg&size=m sc-204464 http://virology-online.com/general/ELISA.jpg Piezoelektrický biosenzor http://www.peta.unas.cz/biosenzory/Biosenzory_soubory/obrazky/piezo.gif http://www.tms.org/pubs/journals/JOM/0010/Kumar/fig4.gif http://www.tms.org/pubs/journals/JOM/0010/Kumar/fig5.gif Kantilever biosensor.gif http://www.intechopen.com/source/html/43444/media/image6.png