19/11/2015
1
ANALYTICKÁ CHEMIE V
POINT-OF-CARE (POC) DIAGNOSTICE
Doc. RNDr. Petr Kubáň, Ph.D.
CEITEC Masarykova Universita
Skupina Bioanalytická Instrumentace
petr.kuban@ceitec.muni.cz
Point-of-care (POC) diagnostika
Diagnostické technologie, které umožňují analýzu vzorků pacientů mimo
klinickou laboratoř (doma, v terénu, ve vozech RZS)
Obvykle malé, jednoduché přístroje/zařízeníkteré jsou schopné provést
analýzu důležitých biomarkerů v klinických vzorcích (krev, sliny, moč)
Snižují dobu analýzy a nutnost transportu vzorku
ANALÝZA DECHU
Hippokrates (460 BC – c. 370 BC)
fetor oris and fetor hepaticus in his treatise on breath aroma
and disease
Hippocrates, The Corpus: The Hippocratic Writings, Kaplan
Publishing, New York, 2008.
The Hippocratic Corpus (Latin: Corpus
Hippocraticum)is a collection of around
seventy early medical works from
Alexandrian Greece.Itis written in Ionic
Greek
TROCHA HISTORIE
URINE WHEEL – POC diagnostika v 15 století
1506 by Ulrich Pinder Epiphanie Medicorum
Testování moči - uroskopie
Sladká - diabetes
Hnědavá - žloutenka
Červené zbarvení, pěna - ledviny
Krev - rakovina močového ústrojí
TROCHA HISTORIE
1897 Nebelthau jedinci, kteří trpí cukrovkou mají v
dechu aceton
1874 Anstie alkohol je obsažen i v dechu
1927 Bogen první alko tester
McNalley Breathalyzer
1936 Patent Harger
PŘÍKLADY POC ZAŘÍZENÍ
Na jedno použití
Ruční
Přenosné
Laboratorní (přenosné)
19/11/2015
2
DRUHY POC ZAŘÍZENÍ
Indikátorovépapírky (analyty v moči, pH, atd)
Papírovémikrofluidické platformy
Lateral flow assays (LFA)
Mikrofluidické analyzátory
Zařízení na bázi chytrých telefonů
http://www.nanowerk.com/spotlight/spotid=21383.php
IDEÁLNÍ POC ZAŘÍZENÍ
INDIKÁTOROVÉ PAPÍRKY
IndikátorovépH papírky s rozsahemměření pH 5,0-9,0 jsou
vhodné pro orientační měření pH, např. při zjišťováníkyselosti
organismu a následné úpravěstravovacího režimu.
Analyty: bílé krvinky
dusitan
proteiny
pH
krev
ketony
urobilinogen
bilirubin
glukosa
TĚHOTENSKÝ TEST
hCG - lidský choriogonadotropin - hormon
byl objeven v moči těhotných žen poprvé
roku 1927 a na jeho detekci je dnes
založena naprostá většina těhotenských
testů.
hCG glykoproteinový hormon
hCG tvořen dvěma podjednotkami, označovanýmijako α a β α podjednotka hCG není specifická
β podjednotka hormonu hCG je specifická
je hCG možné zjistit také v moči
v sedmdesátých letech 20. století, v souvislostis objevem výše zmíněné β podjednotky hCG a od let devadesátých
můžeme teprve hovořit o těhotenských testech vysokéspolehlivosti, které jsou schopny zachytit těhotenství i
relativně časně, jejichž užití je velmi snadné a výsledek zjistitelný zpravidla během pár minut.
Po aplikaci moč vzlíná testovacím proužkem. Pokud je v moči přítomný hCG, navážese na v testu obsaženou
protilátku spřaženou s barvivem. Takto vzniklý komplex vzlíná k testovací zóně (první okénko), kde je přítomna
další protilátka proti hCG. Dochází k zachyceníimunokomplexu a vytvoření barevné reakce (běžně barevný
proužek, či jiná značka). Zbytek „obarvené“ protilátky dále vzlíná k tzv. kontrolní zóně (druhé okénko), kde se
rovněž zobrazízmíněný barevný efekt, značící, že test byl správněproveden.
Citlivé těhotenské testy jsou schopné zachytit přítomnost hCG v moči od koncentrace 10 mIU/ml, zpravidla však
až od 20mIU/ml. Test je vhodné nejdříve v předpokládaném třetím týdnu těhotenství. Pro srovnání– krevnítest
dokážedetekovat hCG již od hodnoty 2 mIU/ml.
19/11/2015
3
LATERAL FLOW ASSAYS (LFA)
série navzájemse překrývajících membrán
materiál obvykle celulosa, nitrocelulosa, cellulose acetate, skleněná vlákna atd.
LATERAL FLOW ASSAYS (LFA)
SAMPLE PAD – nadávkovánívzorku
– případná separace plasmy (odstranění červených krvinek, atd.)
– uniformní tok vzorku
CONJUGATE PAD – obsahuje protilátky specifické pro analyzovanou látku
– protilátky jsou navázány na částice, které lze detekovat
– modrá barva – latexové částice (velikost nm)
- červená barva – Au nanočástice
MEMBRÁNA – celá řada materilálů, obvykle hydrofilnínitrocelulóza
– na membránu se nanesou dvě zóny, jedna testovací a jedna kontrolní
– testovací zóna obsahujeimobilizované antigeny, které zachytíanalyt s navázanou
barevnou částicí
ABSORBENT PAD
– kontrolní zóna slouží ke kontrole funkčnosticelého LFA
– obvykle celulóza
– udržujekonstantní tok reagentů a vzorku
– sběr odpadu
PŘÍPRAVA LFA
STANDARDNÍ PROVEDENÍ LFA
Protilátka
Stanovovaná
látka
Au nanočástice
KOMPETITIVNÍ LFA
19/11/2015
4
TEST NA AIDS (2012)
VISITECT® HIV 1/2 is a qualitative test for the detection of
antibodies to HIV 1/2 virus in human serum, plasma and whole
blood specimens. The test is easy-to-use, offers high sensitivity
and specificity and produces accurate results within 15
minutes.
VISITECT HIV 1/2
http://www.omegadiagnostics.com/products/by-area/hiv/
TEST NA AIDS (2012)
Omega Diagnostics Group has announced the launch of a
ground-breaking new point-of-care disposable test for the
detection of HIV.
VISITECTCD4 detects CD4 T-cell levels and was developed by
the Burnet Institute in Melbourne, Australia.
An easy-to-use semi-quantitative lateral flow test, it uses a
finger-prick blood sample to produce a visual result in 40
minutes, enabling patients to receive life-saving antiretroviral
treatment before leaving the clinic.
VISITECT® CD4 je test na HIV na jedno použití.
Je semi-kvantitativní, rychlý a stanovuje CD4 v kapce
krve.
CD4 + T-buňky jsou přesný marker pro stanovení
progreseonemocnění.
Test je snadno ovladatelný a poskytuje odpověď na
otázku zda "léčit" nebo "ne“ do 40 minut.
Yen et al. Lab Chip, 2015, 15, 1638
TEST NA EBOLU, HOREČKU DENGUE, ŽLUTOU ZIMNICI
C- reaktivní protein (CRP) je bílkovinou akutního zánětu, a tedy
vysocecitlivý parametr zánětu.
je součástí reakce akutní fázeimunitního obranného systému
jeho hladina v krvise zvyšujeu všech druhů bakteriálních
zánětlivých procesů, a to již za 6-12 hodin od začátku zánětu
vyšetření CRP je považováno za nejčastěji ordinované vyšetření
ve vyspělých zemích západního světa, a to od úrovně
praktického lékaře až po vysoce specializovaná pracoviště.
CRP test
CRP pentamer
v krevní plasmě
19/11/2015
5
GLUKOMETRY
přístrojeurčen0 k domácímu měření glykémie, tzv. selfmonitoring
(sebekontrola) glykémie.
Podle výšeglykémie a na základě předchozích zkušenostílze
odhadnout množstvíinzulinu, které je nutno aplikovat.
Záměrem self-monitoringu je, pomocí systematického měření
glykémie, docílit glykemické křivky nediabetika.
Glukometry také zpravidla umí vypočítat týdenní a měsíční
průměr z naměřených hodnot glykémie.
Většina současných glukometrů využívá k měření glykémie
elektrochemickou metodu, která je založena na měření
elektrického proudu mezi pracovnía registrační elektrodou tzv.
metodou ampérometrie.
Na testačním proužku je úzká kapilára, kterou je krev nasávána
dovnitř.
Zde proběhne oxidace glukózy za vzniku peroxidu vodíku.
Čím více je glukózy v krvi, tím více vznikne molekul peroxidu
vodíku.
Peroxid vodíku je v glukometru elektrolyticky rozkládán.
Takto vzniká proud záporněnabitých částic, jenž může být
změřen glukometrem jako elektrický proud. Velikost proudu
odpovídá výsledné glykémii
https://www.accu-chek.cz/
ACCU CHECK (Roche)
PŘÍKLAD VYUŽITÍ GLUKOMETRU PRO JINÉ ANALÝZY
PAPÍROVÁ MIKROFLUIDIKA
http://gmwgroup.harvard.edu/
A low-cost, rapid test for sickle cell
disease. After centrifugation over an
aqueous multiphase system, blood cells
from a donor with sickle cell disease
separate by density. Dense cells
characteristic of sickle cell disease form a
red layer at the bottom of the test.
Srpkovitá anemie
Průměrná délka života lidí postižených touto nemocí je 42 let u
mužů a 48 let u žen
změna tvaru červených krvinekz
tzv. promáčknutých piškotů na
protažené srpky
19/11/2015
6
A paper-based electrochemical sensor that can
be read with a commercial glucose meter. (A)
Wax printing allows the high-throughput
production of devices with hydrophobic regions
and screen printing is used to add electrodes on
top of the printed devices. (B) Comparison of a
commercial test strip for glucose with a paperbased
test strip. (C) The paper-based test strip
fits into a commercial glucose meter.
A universal mobile electrochemical
detector (uMED). The uMED device (left)
can perform a variety of electrochemical
analyses on commercial and custom
electrodes. Results can be transferred
through the audio jack of any phone to
enable connectivity (right).
A peak flow meter is commonly used by a person with asthma to measure the
amount of air that can be expelled from the lungs. If the airways become
narrow or blocked due to asthma, peak flow values will drop because the
person cannot blow air out of the lungs as well. A peak flow meter can be a
useful aid in monitoring a person's asthma over time and can also be used to
help determine how well a patient's medications are working.
MONITORING DECHU
NO MONITORING
www.nioxmino.com,www.aerocrine.com
ASTHMA
Asthma is a
disease that
causes the
airways of the
lungs to swell
and narrow,
leading to
wheezing,
shortness of
breath, chest
tightness, and
coughing.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedhealth/aboutnlm/
19/11/2015
7
RAKOVINA PLIC
nemalobuněčný typ a malobuněčný typ
nemalobuněčný plicní karcinom (NSCLC) se někdy léčí chirurgicky
malobuněčný plicní karcinom (SCLC) má obvykle lepší odezvu na léčbu chemoterapií
nejčastějšíformou rakoviny na světě
39
BREATH ANALYSIS
Some analytes can be analyzed by CE-C4D, some by CE-LIF
Average person exhales
between 10-90.000 L
of air per day
40Breath ResearchInstitute of the Austrian
Academy of Sciences
Antoine Lavoisiser 1784
ANALÝZA DECHU
42
KONDENZÁT VYDECHOVANÉHO VZDUCHU
(EBC)– analýza jednoho výdechu
Price: 0,05 EUR
Volume of EBC/1 breath:
20 µL
Price: 20 EUR
Volume of EBC/1 breath :
25 µL
19/11/2015
8
43
EXHALED BREATH CONDENSATE
(EBC)
44
1.5 2 2.5 3 3.5 4
Time (min)
C4Dsignal(mV)
5 mV
A
B
C
D
E
F
ClNO2-
NO3SO42-
acetate
propionate
butyrate
5 výdechů po sobě, analýza
1.5 2 2.5 3 3.5 4
Time (min)
C4Dsignal(mV)
5 mV
A
B
C
D
E
F
NH4
+
K+
Ca2+
Na+
Mg2+
45
PŘENOSNÝ CE PŘÍSTROJ
ANALÝZA EBC
STD
CF
H
46
Glutathion (GSH) v EBC
1000x nižší LOD než C4D !!
47
Glutathion (GSH) ve slinách
CF – cystická fibróza
lidská dědičná nemoc, která postihuje převážně dýchací a trávicí soustavu.
Jde o autozomální recesivní vrozené onemocnění způsobené mutací
genu produkujícího protein CFTR (anglicky Cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator).
Léčba se v současnosti soustřeďuje zejména na léčbu dýchacího ústrojí –
inhalace, fyzioterapie, antibiotika. Nemocní užívají trávicí enzymy v
kapslích, tedy na odstraňování důsledků onemocnění. Jeho příčina je
léčitelná, ale zatím nevyléčitelná.[1]
Polovina nemocných se dnes v České republice dožívá alespoň 32 let.
Předpokládá se, že každý 25. člověk v populaci je přenašečem
postiženého genu, ale jelikož má jednu kopii poškozenou a druhou v
pořádku, onemocnění se u něho neprojevuje
19/11/2015
9
49
DIAGNOSTIKA CF
DIAGNÓZA:
dědičné onemocnění
nefunkční iontový transport
dýchycí obtíže, infekce, GI trakt
atd.
ZVÝŠENÁ HLADINA
CHLORIDÚV POTU
50
POTNÍ TEST
ALTERNATIVNÍ SBĚR POTU
BOLESTIVÉ
POUŽITÍ CHEMIKÁLIÍ NA POKOŽCE
(pilocarpine)
DOBA TESTU ca 30 MINUT
BEZBOLESTNÝ
BEZ POUŽITÍ CHEMIKÁLIÍ (DI
WATER)
DOBA TESTU ca 10 VTEŘIN
51
CE-C4D SIMULTÁNNÍANALÝZA IONTŮ
CF 1
CF 2
H
52
POUŽITÍ IONTOVÝCH POMĚRŮ vs. CHLORIDY
PCAV DIAGNOSTICECF
-3 -2 -1 0 1 2 3
-3
-2
-1
0
1
2
3
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7H8
H9
H10
CF1
CF2
CF3
CF4
CF5
CF6
CF7
CF8
CF9
CF10
CF11
CF12
CF13
CF14
CF15
CF16
healthy individuals
pediatric CF patients
adult CF patients
Principalcomponent2(33.1%)
Principal component 1 (65.9 %)
54
KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA(CE) V
DIAGNOSTICE OTRAV
RYCHLÁ
MALÉ OBJEMY VZORKŮ
VYSOKÉ ROZLIŠENÍ
POTENCIÁL
+ -
19/11/2015
10
METABOLISMUS METANOLU
CE
56
MOŽNOST DETEKCE METANOLU
ALKOTESTEREM?
NEED FOR INVASIVE SAMPLING – BLOOD/SERUM
PACIENT INTOXIKOVANÝ METANOLEM
UMÉLÉ DÝCHÁNÍ
NO FORMATE IN
BREATH CONDENSATE
58
CE SEPARACE KREVNÍHO SÉRAPACIENTA
OTRÁVENÉHO METANOLEM
MONITORING OF
HAEMOLYTIC
TREATMENT
standard
patient
haemolytic
treatment
PŘENOSNÝANALYZÁTOR INTOXIKACE
METANOLEM (GRANT TAČR)
Je schopen zjistit přítomnost metanolu a kyseliny mravenční do 5-10 min
Analýza z kapky krevního séra (1-10 uL)
Jednoduché použití, ambulance, vozidla RZS
OTRAVY ETHYLENGLYCOLEM
occurs usually as unitentional ingestion of
antifreeze (small children, pets)
Symptoms not easy to distinguish from other
intoxications
19/11/2015
11
ETHYLENE GLYCOL INTOXICATION
62
CE ANALÝZABIOLOGICKÝCH VZORKŮ
ZÁVĚR
ANALYTICKÁ CHEMIE NALÉZÁ ZNAČNÉ UPLATNĚNÍ V POC
DIAGNOSTICE
JEDNODUCHOSTJE HLAVNÍ DEVIZA
POUŽITÍ V TERÉNU, LEVNÉ ZAŘÍZENÍ
JE STÁLE CO OBJEVOVAT J