Luminiscencia   Jozef  Hritz   jozef.hritz@ceitec.muni.cz   Nápad  na  prak;ckú  aplikáciu:  Kontrola  čistoty  mäsa  na  bytúnku   Základné  pojmy   Luminiscenciou  nazývame  emisiu  svetla  atómu,  alebo  molekuly,     ktorá  sa  odohráva  z  excitovaného  stavu  elektrónu     Luminiscencia  sa  formálne  delí  na  fluorescenciu  a  fosforescenciu     v  závislos;  na  charaktere  elektronového  excitovaného  stavu.     Fluoroforom  nazývame  látku  schopnú  absorbovať  a  emitovať  svetlo.   Objav  Fluorescencie   Fluorescenciou  nazývame  jav  pri  ktorom  je  svetlo  emitované  atómom  alebo  molekulou  po     ohraničenej  dobe  nasledujúcej  po  absorpcii  elektromagne;ckého  žiarenia     σ*-­‐σ  malokedy  vedú  ku  luminiscencii.  Veľmi  vysoká  energia  (λ<250nm)                    vedie  zväčša  ku  disociácii  molekúl   Emisie  sú  najčastejšie  pre  prechody  π*-­‐π,  niekedy  aj  π*-­‐n   Typické  fluorofóry   •  Molekuly  obsahujúce  konjugované  π   elektróny   Energe;cké  hladiny  v  molekule   En,v,J=En+Ev+EJ   En-­‐elektrónová  energia   EV-­‐vibračná  energia   EJ-­‐rotačná  energia     Kvalitaevne  porovnanie  jednotlivých     energe;ckých  komponent:   En(UV-­‐VIS)  >>  EV  (IR)  >>  EJ(MW)   Čo  určuje  tvar  absorbčného  spektra?   Frank-­‐Condonov  princíp:   Ver;kálne  prechody  elektrónu,  ktoré   sa  odohrávajú  na  omnoho  rýchlejšej     časovej  škále  ako  pohyb  jadier  atómov.   Pravdepodobnosť  prechodu  závisí  od   prekryvu  vibračných  vlnových  funkcií       Absorbcia  10-­‐15s   Vibrácie  atómov      10-­‐12s-­‐10-­‐10s   Termálna  relaxácia    10-­‐15s-­‐10-­‐12s   Fluorescenčná  emisia    10-­‐9s   Typické  charakteris;ky   fluorescenčných  spek;er   •  Stoksov  posun   •  Nezávislosť  emisného  spektra      na  excitačnej  vlnovej  dĺžke   •  Excitačné  spektrum  “rozumne  sa      správajúcich  molekúl”  je  prak;cky      totožné  s  absorbčným  spektrom     •  Emisné  spektrum  je  vo  väčšine      prípadoch  takmer  zrkadlovým      obrazom  absorbčného/excitačného      spektra   Kasha’s  Rule   Jablonského  diagram   (10-­‐14-­‐10-­‐10s   (10-­‐10-­‐10-­‐8s   (~10-­‐15s)   (~10-­‐9-­‐10-­‐6s)   Kvantový  výťažok   Φ = !"č!"!!"#$%&'(ý!ℎ!!"#ó!"# !"č!"!!"#$%"$&!'ý!ℎ!!"#ó!"# ! f f i ec ic pd d k k k k k k k φ = + + + + + kf  =  fluorescenčná  rýchlostná  konštanta   ki  =  medzi-­‐systémová  výmenná  rýchlostná   konštanta   kec  =    rýchlostná  konštanta  externej   konverzie   kic  =    rýchlostná  konštanta  internej   konverzie   kpd  =  predisociačná    rýchlostná  konštanta   kd  =  disociačná    rýchlostná  konštanta   Fluorescenčný  spektrofotometer   Fluorescenčný  mikroskop   Fluorescence  microscopy   •  Subcellular  fluorescence  imaging   – Combined  with  recombinantly-­‐expressed   fluorophores  (GFP,  etc.—Roger  Tsien)  has   revolu;onized  biology.   h•p://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/anatomy/fluoromicroanatomy.html   h•p://www.rp-­‐photonics.com/img/kahn_fl_image.jpg   Försterov  Rezonančný  Transfer   Energie  (FRET)   R0-­‐Försterov  polomer/vzdialenosť   Efekevnosť  FRET   r  –  vzdialenosť  medzi  akceptorom                a  donorom     κ2  –  popisuje  vzájomnú  relaevnu                  orientáciu  tranzitných  dipólov                  donoru  a  akceptora.                    Pre  flexibilný  náhodný  pohyb                  akceptora  a  donora  sa  κ2=2/3     Alexa 488 Alexa 647 Alexa 488 Alexa 594 MD  simulácie  Hanky  Zigovej   Monitorovanie  skladania  proteínov     in  vivo   Fluorescenčná  anizotropia   Anizotrópia   Polarizácia:   Viazanie  ligandu  do  receptoru   Ďalšie  čítanie   •  Lakowicz,  J.  R.  (2006)  Principles  of   Fluorescence  Spectroscopy   h•p://xibalba.lcg.unam.mx/~rgalindo/bioquimica/ BQPosgrado2011/V  PurificacionEspeectroscopia/ PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy3rd.pdf)