NMR/EPR  Proteínov   Jozef  Hritz   Central  European  Ins/tute  of  Technology  (CEITEC)     Structural  Biology,  Brno   Základné  pojmy   ΔE = γ h Bo / 2π = h νo / 2π γ – gyromagne@cký  pomer   νo– Larmorova  frekvencia   h – Planckova  konštanta       Výsledná  nenulová  Magne@zácia  M0   vo  vonkajšom  magne@ckom  poli  B0   M0   = µ  ∑ = 0 Odhad  citlivos@  NMR   Aký  je  podiel  protónov  ktorých  spiny  smerujú  nahor  (smer  B0)  vs.  nadol     v  magne@ckom  poli  22.3  T  (950MHz)?       Nα/Nβ  =  exp(ΔE/kT)        =  exp((22.3T  *  26.75*107  T-­‐1s-­‐1  *  1.05*10-­‐34Js)/(1.38*10-­‐23  J.K-­‐1  *  297K)      =  exp(0.000153)      =    1.000153     Pre  celkový  počet  protónov  2000153  ich  bude  smerovať   nahor:  1000153   nadol:  1000000     Citlivosť  NMR  metódy  je  omnoho  nižšia  v  porovnaní  s  napr.  op@ckými  metódami     Princíp  NMR  pulzných  meraní   pri vhodnom výkone a dlžke rf pulzu Mo z x B1 y ωo Bo Receiver coil (x) ⇒ NMR signal z x Mxy y ωo Bo Schéma  NMR  spektrometra   The chemical shift Chemický posun atómu závisí na: • type atómu (HN, alifatický, aromatický vodík, ...) • type aminokyseliny (Ala, Phe, ...) • chemické okolie atómu V praxi sa namiesto rezonančnej frekvencie určitého atómu používa chemický posun, ktorý je definovany ako: ν(vzorka) – ν(referencia) frekvencia NMR spektrometra δ (ppm) = 106 • Výhody: • kompaktnejší zápis • nezávislosť na poli NMR spektrometra Typický rozsah 1H chemických posunov: 0-10 ppm Prak@cké  aspekty  NMR  proteínov   •  Potrebné  značné  množstvo  proteínu  v  op@málnej   koncentrácii  >  1mM.  V  mnohých  prípadoch   potrebné  izotopické  značenie   •  Poskytuje  informáciu  o  jednotlivých   aminokyselinách/atómoch   •  Určenie  3D  štrukúry  je  časovo  aj  finančne   relapvne  náročné   •   NMR  umožnuje  dať  aj  čiastočnejšiu  odpoveď   použipm  jednoduchších/rýchlejších  experimentov         Typické 1H 1D spektrum peptidu N H C H C N O HCH2 8 7 6 5 4 3 2 ppm 1D  1H  NMR  spektrum  ubiquipnu   U  denaturovaného  ubiquipnu  sú   peaky  širšie  a  v  oblas@  amidických   vodíkov  sú  rozprestrené  v  podstatne   užšej  oblas@  ako  je  tomu  u  zbaleného   ubiquipnu  (~6-­‐10  ppm)     Použiteľnosť  ako  pre  izotopicky  značené,   tak  aj  neznačené  vzorky  proteínov   Korelačná spektroskopia N H C H C N O H CH3 CH H3C transfer magnetizácie cez kovalentné chemické vazby (J-couplings) transfer magnetizácie cez priestor (NOE) prenos  magne@zácie  z  jedneho  jadra  (zdroja)  na  iné  jadro   (príjemca)     Charakteris@cké  HSQC  pre  zbalený  a   rozbalený  proteín   Rozbalený                                                  Zbalený  proteín   •  Je  potrebná  15N  izotopicky      značená  vzorka   •  Opro@  1D  1H  spektru  omnoho   vyššie  rozlíšenie,  jeden  peak   zodpovedá  jednej  amidickej   skupine.     •  Častokrát  označované  aj  ako   proteín                “finger-­‐print”  experiment       Hlavné  rozdiely  pre  zbaleny  vs.   nezbalený  propn  v  disperzii  a     šírke  peakov     Problémy  NMR  väčších  proteínov   U  väčších  proteínov  zvačšujúca  sa  šírka  peakov  z  dôvodu  väčšieho  rotačného  korelačného  času   Väčšia  šírka  peakov  spolu  s  ich  vyšším  počtom  vedie  k  prekryvu  peakov  a  problémom  s  ich     rozlíšením.     Vplyv  vyššieho  magne@ckého  poľa     na  rozlíšenie  spektra   Trosy  HSQC   3D  NMR  spektroskopia   Príklad  zvýšeného  rozlíšenia  na  3D  HNCA  NMR  experimente     Priradenie  peakov  v  HSQC  jednotlivým   aminokyselinám  pomocou  HNCA   V  HNCA  experimente  sú  korelované   chemické  posuny  1HN,    15N,    13Cα i  a  13Cα i-­‐1     Priradenie  peakov  v  HSQC  jednotlivým   aminokyselinám  pomocou  HNCA   Pri  väčších  proteínoch  problém  s  rozlíšením   silnejších  a  slabších  signálov,  prekryv  ….     Priradenie  kostry  väčších  proteínov     Veľké  Puzzle   Sekvenčné  priradenie   Predikcia  sekundárnej  štruktúry   Cα,  Cβb  a  CO  chemické  posuny  relapvne     k  hodnotám  pre  náhodný  reťazec  majú   výraznú  koreláciu  s  torznými  uhlami     kostry  proteínu  ϕ  a  ψ.       Wishart,  D.S.  and  B.D.  Sykes.  The  13C  chemical     shi€  index.  A  simple  method  for  the  iden@fica@on    of  protein  secondary  structure  using  13C  chemical shi€  data.  J.  Biomol.  NMR  4:171-­‐180  (1994)   A  2D  plane  of  a  3D  NMR  spectrum  (NOESY)   NOE~r-­‐6   Silné NOE 1.8 - 2.7 Å Stredné NOE 1.8 - 3.3 Å Slabé NOE 1.8 - 5.0 Å i+4 i+3 i+2 i C N C N N C N C dα(i)N(j) i+1 dαβ(i, i+3) dαN(i, i+3) dNN(i, i+3) dαN (i, i+4) Cieľom  je  nájsť  takú  3D  štruktúru  proteínu,  ktorá  ma  čo  najlepšiu  zhodu  s:    -­‐  nameranou  sadou  NOE  proton-­‐proton  párov    -­‐  torzné  uhly  dané  3J  coupling  prostredníctvom  Karplusovej  rovnice:     3J = A * cos( φ )2 + B cos( φ ) + C    -­‐  predpoveďou  sekundárnych  štruktúr  pre  jednotlive  aminokyseliny    -­‐  RDCs  (residual  dipolar  couplings)     -­‐  PRE  data   Jednou  z  možnosX  nájdenia  rozumných  proteínovych  štruktúr  je  použiť   opZmalizačnú  techniku  simulovaného  žíhania  kde  v  rámci  molekulej  dynamiky  sú   zavedené  jednotlivé  geometrické  obmedzenia  spolu  so  štandardnými   parametrali  silového  poľa.  Pre  NOE:   Určenie  štruktúry  proteínu  pomocou  NMR   ENOE = KNOE * ( rcalc - rmax )2 pre rcalc > rmax ENOE = 0 pre rmax > rcalc > rmin ENOE = KNOE * ( rmin - rcalc )2 pre rcalc < rmin Pozor:  Proteíny  sú  flexibilné!   NOE  distance  1   NOE  distance  2   NOE~r-­‐6   Efekt  mutácie/fosforylácie   Titračné  merania   1H-­‐15N  HSQC  @trácia  v  režime  rýchlej   výmeny   Možnosť  sledovať  viazanie     ligandu  simultánne  do  viacerých   väzobných  miest   Byeon  I-­‐J.  ,  Ahn  J.,  Mitra  M.,  Byeon  C-­‐H.,  Hercík  K.,  Hritz  J.,  Charlton  L.,  Levin  J.,     Gronenborn  A.M.  NMR  structure  of  human  restric@on  factor  APOBEC3A  reveals   substrate  binding  and  enzyme  specificity.  Nature  Commun.  2013,  4,  1890     NMR  @trácie  ako  nástroj  pre  filtrovanie   súboru  väzobných  konformacií  ligandu   generovaného  molekulovým  dokovaním   EPR  (Electron  paramagne@c  resonance)     -­‐  @ež  nazývaná:  Electron  Spin  Resonance  (ESR)     EPR  ak@vne  molekuly  obsahujú  nespárovaný  elektrón,   t.j.  majú  nenulový  spin-­‐angular  moment       Porovnanie  magne@ckých  dipólových  monetov:   -­‐  protónu:    ~14x10-­‐27  J.T-­‐1   -­‐  elektrónu:  ~  -­‐9285x10-­‐27  J.T-­‐1                     Zemanove  š@epenie  energe@ckých  hladín  elektrónu:  ΔE  =  ge  μB  B0  =  hν   B0-­‐externé  magne@cké  pole   ge-­‐  tzv.  g-­‐faktor,  ktorý  závisí  od  typu  molekuly  (typické  hodnoty:  1-­‐10)   μB-­‐  Bohrov  magnetron       Typical  frequency  range  of  EPR:  ~10  GHz         V  súčasnos@  približný  možný  rozsah  vzdialenos@  určiteľnými  EPR  spektroskopiou:  15-­‐100  Å     Dipol-­‐dipolová  interakcia  ~  μ1μ2/r3     !Interpretácia  flexibilných  paramagne@ckých  značiek   NMR  spektroskopia  biomaktromolekuly   obsahujúcej  paramagne@ckú  značku   Paramagne@c  relaxa@on  enhancements  (PRE),  efekpvne  do  približne  20    Å.     Záver   •  Nízka  citlivosť  NMR  podmieňuje  vysokú  koncentráciu  meraných  proteínov   •  BioNMR  umožňuje  sledovať  štrukturálne  zmeny  na  úrovni  jednotlivých  aminokyselín   a  to  pre  štrukturované  ako  aj  tvz.  neštrukturované  proteíny  (IDP)   •  NMR  väčších  proteínov  vyžaduje  okrem  izotopického  značenia  15N,  13C  aj  ich   deuteráciu  a  NMR  spektrometer  s  vysokým  magne@ckým  poľom  (>700  MHz).  Ďalšou   možnosťou  je  ich  selekpvne  značenie.   •  Určenie  štruktúry  proteínov  na  základe  stanovených  geometrických  obmedzení   (vzdialenostných,  uhlových)   •  NMR  umožňuje  určiť  aj  značne  komplexný  väzobný  mechanizmus,  kde  dochádza  k   interakcii  viacerých  väzobných  miest.     •  EPR  signál  od  molekúl  obsahujúcich  nespárované  elektróny.  Moznosť  merať   vzdialenos@  medzi  paramagne@ckými  značkami  v  rozmedzí  15-­‐100  Å   •  PRE  efekt  umožňuje  používať  paramagne@ckú  značku  ako  maják  na  reziduá  vo   vzdialenos@  do  20  Å