BIOSENSORY A JEJICH APLIKACE Mgr. Šárka Bidmanová, Ph.D. 77580@mail.muni.cz Biosensory  Historie  Počátek 20. st. – měření pH  1922 – Heyrovský – objev polarografie  1956 – Clark – kyslíková elektroda  1962 – Clark, Lyons – enzymová elektroda  1975 – Yellow Springs Instrument Company (USA) – 1. komerční biosensor pro stanovení glukosy  1975 – pojem biosensor  1975 – Lübbers, Opitz – optoda  80. léta 20. st. – Liedberg – imunosensory  1987 – MediSense – komerční biosensor pro stanovení glukosy v krvi diabetiků Biosensory  Analytické přístroje  Biorekogniční složka v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem Analyt Převodník Biorekogniční složka Výstupní signál Biosensory vs. tradiční metody Charakteristiky Tradiční analytické metody Biosensory Citlivost Selektivita Příprava vzorku Spotřeba chemikálií Mód měření Časová náročnost Nároky na obsluhu a vybavení Ekonomické náklady Standardizace měření Komerční dostupnost Průběh měření s biosensory  Po ustálení pozadí signálu – přídavek vzorku s analytem  Měření  Kineticky – citlivost = časová změna signálu v důsledku změny koncentrace analytu Δ(dS/dt)/Δc  Ustálený stav („steady state“) – citlivost = konečná ustálená změna výstupního signálu v důsledku změny koncentrace analytu ΔS/Δc dS/dt ΔS Průběh měření s biosensory  Šum – elektromagnetické povahy, turbulence při míchání, rázy pumpy v průtokovém uspořádání  Signál pozadí – signál v nepřítomnosti analytu, odečet od měřeného signálu Pozadí Přídavek analytu Šum Kalibrace biosensoru  Signál biosensoru po přídavku různých koncentrací známého analytu  Kalibrační závislost – nejvhodnější přímka  Limit detekce = nejnižší stanovitelná koncentrace analytu S/N = 3 0 10 20 30 40 50 60 70 0.0 0.5 1.0 Změnasignálu Koncentrace (mg.l-1) Kalibrační závislost Limit detekce Oblast linearity ΔS/Δc Základní pojmy  Dlouhodobá stabilita – změny citlivosti biosensoru v čase, obvykle pokles citlivosti  Selektivita biosensoru – odezva biosensoru pouze na stanovovaný analyt, ostatní látky bez vlivu na signál 0 20 40 60 80 100 120 Relativnísignál(%) Základní pojmy  Doba odezvy biosensoru – čas potřebný k dosažení určité velikosti signálu v konečném ustáleném stavu  Životnost biosensoru – limitace biorekogniční složkou  Stabilita při skladování  Operační stabilita  Biokompatibilita – význam pro biomedicínské aplikace ΔS95 t95 Měřící uspořádání  Přímý kontakt se vzorkem  Biosensor přímo ve sledovaném prostředí  Měření v nádobce  Přídavek vzorku po ustálení pozadí signálu  Průtočný systém  Střídavý průtok základního roztoku a roztoku vzorků  Vstřikování vzorků do protékajícího základního roztoku  Biorekogniční element v kontaktu s převodníkem  Nejjednodušší – překrytí převodníku dialyzační membránou  Imobilizace  Zachycení  Adsorpce  Kovalentní navázání  Zesíťování  Afinitní navázání Imobilizace biorekogniční složky  Biorekogniční složka  Enzym  Buňka  Organela  Tkáň  Protilátka  Nukleová kyselina  Receptor Biokatalytické biosensory Bioafinitní biosensory Biorekogniční složka Substrát Produkt Převodník Převodník Specificita Enzymy Protilátky DNA Receptory Organely Tkáně Buňky Vysoká Nízká Stabilita Buňky Tkáně Organely Protilátky DNA Enzymy Receptory Biorekogniční složka Převodníky  Fyzikálně-chemické převodníky – signál k dalšímu zpracování  Elektrochemické  Optické  Piezoelektrické a akustické  Kalorimetrické Elektrochemické převodníky  Nejčastější  Jednoduchá konstrukce, nízké náklady, výborná citlivost, nízké detekční limity, velký dynamický rozsah  Měřící systém nejméně ze 2 elektrod – pracovní a referentní  Typy  Potenciometrické  Amperometrické  Konduktometrické Elektrochemické převodníky  Pracovní elektrody  Potenciál elektrody volen tak, aby nedocházelo k elektrochemickému rozkladu materiálu elektrody  Ušlechtilé kovy (Pt, Au), skelný uhlík, grafit, kompozitní směsi  Referentní elektrody  Srovnávací bod k měření nebo nastavení potenciálu pracovních elektrod  Normální vodíková elektroda, kalomelové elektrody, argentchloridové elektrody  Pomocné elektrody  Dobrý vodič s dostatečnou plochou, elektrochemicky neaktivní  Platina, uhlíková tyčinka Potenciometrické převodníky  Rozdíl elektrického potenciálu mezi pracovní a referentní elektrodou  V systému neprochází elektrický proud  Pracovní elektroda  Selektivní pro ionty nebo plyny  Stanovení – H+, F-, Cl-, I-, CN-, CO2, NH3 Nasycený KCl Hg Hg2Cl2 Platinový drátek Nasycený roztok KCl/Hg2Cl2 pH-citlivá skleněná membrána 0,1M HCl Koncentrovaný roztok KCl/AgCl Ag/AgCl referenční elektroda Vnitřní elektrolyt Kalomelová elektroda Skleněná elektroda Iontově-selektivní elektroda Membrána propustná pro ionty Vnitřní referenční elektroda Vnitřní elektrolyt Potenciometrické biosensory Analyt Biorekogniční element Princip detekce Penicilin Penicilinasa pH Acetylcholin Acetylcholinesterasa pH Glukosa Glukosaoxidasa pH Močovina Ureasa NH3/NH4 + Aminokyseliny Glutamátdehydrogenasa, oxidasa aminokyselin NH3/NH4 + Močovina Ureasa CO2 Aminokyseliny Lysindekarboxylasa CO2 H2O2 Peroxidasa I- Amperometrické převodníky  Měřen elektrický proud vzniklý elektrochemickou oxidací nebo redukcí elektroaktivní látky za konstantního napětí na pracovní elektrodě  Amperometrická měření  Dvouelektrodový systém – napětí na pracovní elektrodě nastaveno proti pomocné elektrodě  Tříelektrodový systém – navíc referentní elektroda, univerzální uspořádání  Stanovení kyslíku  Kyslíková elektroda s předřazenou membránou propustnou pouze pro O2  Elektrodová redukce O2: O2 + 2 H2O + 2e- H2O2 + 2 OHH2O2 + 2 e- 2 OH Stanovení peroxidu vodíku  Elektrodová oxidace peroxidu vodíku: H2O2 O2 + 2 e- + 2 H+ Amperometrické převodníky Zlatá nebo platinová elektroda zatavená ve skle Ag/AgCl elektroda Elektrolyt Membrána propustná pro kyslík Amperometrické biosensory  Biorekogniční složka - oxidasy  Spojení s kyslíkovou nebo peroxidovou elektrodou Substrát + O2 produkt + H2O2 Substrát + O2 produkt + H2O Analyt Biorekogniční element Koenzym Princip detekce Alkohol Alkoholoxidasa FAD H2O2 Fenol Tyrosinasa Cu2+ O2 Glukosa Glukosaoxidasa FAD H2O2 Laktát Laktátoxidasa FAD H2O2 Pyruvát Pyruvátoxidasa FAD H2O2 Konduktometrické převodníky  Změna vodivosti při biochemických reakcích  Produkce a spotřeba iontů  Změna velikosti nabitých částic  Konduktometrické biosensory – stanovení močoviny pomocí ureasy NH2CONH2 + 3 H2O 2 NH4 + + HCO3 - + OHDetail elektrod Kontakty Izolace Elektrody s nanesenou enzymovou vrstvou Optické převodníky  Princip – interakce světelného záření s chemickými látkami  Typy  Absorbance, fluorescence, chemi/bioluminiscence – katalytické biosensory  Nelineární optika – afinitní biosensory Optické (bio)sensory  Detektory  Fotonásobiče  Fotodiody  Zdroje světla  Laser  Světloemitující diody (LED)  UV výbojky  Lampy Xenonová Rtuťová výbojka LEDLaser Fotonásobič Fotodioda Optické (bio)sensory  Výhody  Bez referentního prvku  Stabilní kalibrace  Současné stanovení několika analytů  Bez interferencí elektromagnetické povahy  Nevýhody  Omezený dynamický rozsah  Omezená dlouhodobá stabilita  Bez reference při měření intenzity světla  Interference okolního záření Optické (bio)sensory  Optická vlákna (průměr do stovek µm)  Jádro – křemen, sklo, plast  Plášť – silikonový  Mechanický obal - plast  Šíření paprsku v optickém vláknu – úhel dopadu větší než kritická mez Optické vlákno Plášť Jádro Obal Optické vlákno LED Plášť JádroÚhel 60° Jádro Optické (bio)sensory  Měřící konfigurace Fotodetektor Zdroj záření Detekční oblast Analyt Analyt Analyt Fotodetektor Optické vlákno Zdroj záření Rozdvojené optické vlákno Detekční oblast Fotodetektor Zdroj záření Optické (bio)sensory  Přímé měření  Výskyt opticky aktivní látky v biokatalytické reakci, např. NADH  Nepřímé měření  Využití optických indikátorů  Sledování kyslíku – organokovové komplexy ruthenia, kyselina pyrenmáselná  Sledování pH – fluorescein, kyselina 1-hydroxypyren-3,6,8-trisulfonová Optické biosensory Analyt Biorekogniční element Princip detekce Alkohol Alkoholdehydrogenasa Fluorescence NADH Metabolická aktivita Mikrobiální buňka Fluorescence NADH Toxicita Řasa, sinice Fluorescence chlorofylu Glukosa Glukosaoxidasa Fluorescence, O2 indikátor Penicilin Penicilinasa Fluorescence, pH indikátor Močovina Ureasa Fluorescence, pH indikátor H2O2 Peroxidasa Chemiluminiscence, luminol ATP Luciferasa Bioluminiscence, luciferin Optické biosensory  Biosensory s povrchovou plasmovou rezonancí (SPR)  Pokles intenzity odraženého světla na rozhraní kov-dielektrikum při totálním odrazu světla  Posun rezonančního maxima při interakci protilátka-antigen Polarizované světlo Průtočný systém Sensorový čip se zlatou vrstvou Odražené záření Sensorgram Úhel Čas Hranol Intenzita Resonance Zdroj záření Detektor Piezoelektrické převodníky  Piezoelektrický krystalový rezonátor (QCM)  Změna rezonanční frekvence krystalového rezonátoru  Detekce plynů, interakce antigen-protilátka Elektrody na protilehlých stranách Křemenná destička Nosné drátky KontaktyIzolační základna Vibrace piezoelektrického elementu Kalorimetrické převodníky  Změna teploty v průběhu chemických reakcí  Termistor – odpor závislý na teplotě Vzorek Odpad Vnější izolace Hliníkový blok Referenční termistor Měřící cela Elektronika Pracovní termistor Aplikace biosensorů Medicína Biotechnologie Životní prostředí Vojenství Potravinářství Biosensory Komerční (bio)sensory Medicína • HIV, virus chřipky •E.coli O157, Helicobacter pylori •Streptococcus, Mycobacterium tuberculosis, Legionella •Adenoviry, rotaviry •Markery rakoviny a onemocnění srdce, hormony Životní prostředí •BOD •Dusičnany •Dioxiny Vojenství •Bacillus anthracis •Virus kravských neštovic •Francisella tularensis, Yersinia pestis, Coxiella, Brucella •Vibrio cholerae, Salmonella •Listeria, E. coli O157 •Ricin, botulotoxin Potravinářství •E. coli O157, S. aureus •Salmonella, Campylobacter, Enterococcus •Botulotoxin, choleratoxin •Antibiotika, těžké kovy •Ethanol, methanol Biosensory Medicína •Cl-, Na+ •Glukosa, inzulin •Močovina, ethanol, laktát •Kyselina močová, kreatinin •Hematokrit, krevní plyny •Hemoglobin •Cholesterol Potravinářství •Kyselina askorbová, oxalát •Škrob, peroxid vodíku, cholin •Glukosa, sacharosa, laktosa •Vitamíny rozpustné ve vodě •Glycerol, kyselina mléčná •Glutamát, glutamin Biosensory Komerční (bio)sensory  Nejúspěšnější – biosensory pro detekci krevní glukosy Svrchní ochranná vrstva Referentní elektroda Spacer Pracovní elektroda Spodní vrstva Enzym a mediátor imobilizovány na pracovní elektrodě Komerční elektrochemické (bio)sensory Firma Produkt Oblast uplatnění Abott Point of Care (USA) i-STAT pro pH, O2, CO2, močovinu, laktát, kreatinin Medicína ABTECH Scientific (USA) Mikrosensorové elektrody Medicína, životní prostředí, potravinářství BVT Technologies (ČR) Elektrochemické (bio)sensory Medicína, výzkum Dexcom (USA) Dexcom G4 pro kontinuální monitoring glukosy Medicína LifeScan (USA) Glukometry OneTouch Medicína Roche Diagnostics (Švýcarsko) Glukometry Accu-Chek Medicína Siemens Healthcare Diagnostics (Německo) DCA Vantage Analyzer pro hemoglobin Medicína Windsor Scientific (UK) Mikroelektrody, mikrosensory Medicína Komerční optické (bio)sensory Firma Produkt Oblast uplatnění Artificial Sensing Instruments (Švýcarsko) Afinitní systémy pro studium biointerakcí Výzkum, farmacie, biotechnologie GE Healthcare (UK) BIACORE pro studium biointerakcí Výzkum, farmacie, biotechnologie Hach Lange (Německo) LDO luminescenční sensor pro O2 Životní prostředí, biotechnologie Ocean Optics (USA) NeoFox luminescenční sensor pro pH a O2 Medicína, životní prostředí, biotechnologie PreSens (Německo) Mikrosensory pro pH, O2 a CO2 Medicína, farmacie, potravinářství Sierra Sensors (USA) Afinitní systémy pro studium biointerakcí Výzkum, farmacie, biotechnologie Yellow Springs Instruments (USA) ProOBOD luminescenční sensor pro O2 Životní prostředí Budoucnost biosensorů  Miniaturizace, spojení s mikrofluidikou  Využití nanomateriálů  Využití umělých rekogničních elementů – aptamery, molekulárně-otištěné polymery (MIPs)  Sensorové array + artificiální neuronové sítě Reference  Bahadir E.B., Sezgintürk M.K. (2015): Applications of commercial biosensors in clinical, food, environmental and biothreat/biowarfare analyses. Anal. Biochem. 478: 107-120.  Clarke S.F., Foster J.R. (2012): A history of blood glucose meters and their role in selfmonitoring of diabetes mellitus. Brit. J. Biomed. Sci. 69: 83-93.  Cooper M.A. (2002): Optical biosensors in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 1: 515-528.  Petr Skládal, http://orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/Biosensory.pdf (elektronická verze)  Rodriguez-Mozaz S., Marco M.-P., Lopez de Alda M.J., Barceló D. (2004): Biosensors for environmental applications: Future development trends. Pure Appl. Chem. 76: 723- 752.  Ronkainen N.J., Halsall H.B., Heineman W.R. (2010): Electrochemical biosensors. Chem. Soc. Rev. 39: 1747-1763. Reference  Tuner A.P.F. (2013): Biosensors: sense and sensibility. Chem. Soc. Rew. 42: 3184- 3196.  Yoo E.-H., Lee S.-Y. (2010): Glucose biosensors: An overview of use in clinical practice. Sens. 10: 4558-4576.