Makromolekulami krystalografie Metody biofyzikální chemie - seminář (C5856) Jan Novotný novotnyj anOmail.muni.cz 30. září 2015 -4 30. září 2015 1 / 13 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Neuspořádané části proteinů se projevují intenzivními odezvami v difrakčním obrazci. J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 2 / 13 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Neuspořádané části proteinů se projevují intenzivními odezvami v difrakčním obrazci. O Vzdálenost mezi rovinami ab v elementární buňce (ax,by,cz) se rovná výrazu (axb).c |axb| ' 30. září 2015 2 / Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Neuspořádané části proteinů se projevují intenzivními odezvami v difrakčním obrazci. O Vzdálenost mezi rovinami ab v elementární buňce (ax,by,cz) se rovná výrazu (axb).c |axb| • Q Sekvenční podobnost vyšší než 40% umožňuje využít metodu molekulárního přemístění (Molecular replacement) pro řešení fázového problému. J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 2 / Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Neuspořádané části proteinů se projevují intenzivními odezvami v difrakčním obrazci. O Vzdálenost mezi rovinami ab v elementární buňce (ax,by,cz) se rovná výrazu (axb).c |axb| • Q Sekvenční podobnost vyšší než 40% umožňuje využít metodu molekulárního přemístění (Molecular replacement) pro řešení fázového problému. O Rozlišení metody SAXS se pohybuje v intervalu 1-25 Á. J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 2 / Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Neuspořádané části proteinů se projevují intenzivními odezvami v difrakčním obrazci. O Vzdálenost mezi rovinami ab v elementární buňce (ax,by,cz) se rovná výrazu (axb).c |axb| • Q Sekvenční podobnost vyšší než 40% umožňuje využít metodu molekulárního přemístění (Molecular replacement) pro řešení fázového problému. O Rozlišení metody SAXS se pohybuje v intervalu 1-25 Á. O Vylepšení (refinement) X-ray struktury nezbytně vyžaduje empirické parametry silového pole. J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 2 / Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Neuspořádané části proteinů se projevují intenzivními odezvami v difrakčním obrazci. O Vzdálenost mezi rovinami ab v elementární buňce (ax,by,cz) se rovná výrazu (axb).c |axb| • Q Sekvenční podobnost vyšší než 40% umožňuje využít metodu molekulárního přemístění (Molecular replacement) pro řešení fázového problému. O Rozlišení metody SAXS se pohybuje v intervalu 1-25 Á. O Vylepšení (refinement) X-ray struktury nezbytně vyžaduje empirické parametry silového pole. O Metoda isomorfního přemístění je založena na předpokladu, že strukturní faktor těžkého atomu inkorporovaného do studované struktury je charakterizován fází blízkou fázi pozorované difrakce. J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 2 / Příprava vzorku biomolekuly pro strukturní analýzu K uvedeným charakteristikám se pokuste uvést příklad exp. metody k jejich zjištění: O Homogenita, čistota O Fold, rozpustnost Q Monodisperzní O Aktivita O Stabilita J. Novotný □ ► < 9 S ► 1 30. záFÍ 2015 3 / 13 Příprava vzorku biomolekuly pro strukturní analýzu K uvedeným charakteristikám se poki zjištění: O Homogenita, čistota O Fold, rozpustnost Q Monodisperzní O Aktivita O Stabilita uvést příklad exp. metody k jejich • ELF, MASS • CD, FTIR • DLS, DOSY • enzymatic assay • (viz výše) J. Novotný □ ► < g S ► 1 30. záFÍ 2015 3 / 13 Rentgenová krystalografie vs. SAS vs. NMR spektroskopie Kterou z metod považujete za vhodnější pro řešení následujících problémů a proč? A) Řešení struktury membránového proteinu. B) Určení protonačního stavu cytosinového nukleotidu v i-motivu DNA. C) Strukturní analýza proteinového komplexu o Mr=l MDa. D) Analýza radiální distribuční funkce solvatačního obalu kationtu. E) Strukturní analýza metalloproteinu s paramagnetickým centrem. F) Studium segmentového pohybu domény. H) Určení rozměrů příčného řezu celulózové mikrofibrily ve Inu. J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 4 / Rentgenová krystalografie vs. SAS vs. NMR spektroskopie Kterou z metod považujete za vhodnější pro řešení následujících problémů a proč? A) Řešení struktury membránového proteinu. (ss)NMR B) Určení protonačního stavu cytosinového nukleotidu v i-motivu DNA. NMR C) Strukturní analýza proteinového komplexu o Mr=l MDa. X-ray D) Analýza radiální distribuční funkce solvatačního obalu kationtu. SANS E) Strukturní analýza metalloproteinu s paramagnetickým centrem. X-ray F) Studium segmentového pohybu domény. NMR H) Určení rozměrů příčného řezu celulózové mikrofibrily ve Inu. SAXS J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 4 / Srovnání rozsahu uplatnění strukturních metod Do schématu doplňte na odpovídající místo následující metody: Rentgenová krystalografie, Elektronová tomografie, NMR, Elektronová krystalografie, Světelná mikroskopie, SAXS rozptyl Tkáně Buňky Organely (Makro )molekuly lmm 100 um 10 um 1 um 100 nm 10 nm 1 nm 0.1 nm 1 -00.O i 2015 5 / 13 Srovnání rozsahu uplatnění strukturních metod Do schématu doplňte na odpovídající místo následující metody: Rentgenová krystalografie, Elektronová tomografie, NMR, Elektronová krystalografie, Světelná mikroskopie, SAXS rozptyl Tkáně Buňky Organely (Makro )molekuly lmm 100 um 10 um 1 um 100 nm 10 nm 1 nm 0.1 nm Světelná mikroskopie Elektronová tomografie SAXS Elektronová krystalografie r^s^^^ra J^r^^k^^^^^^fi^ NMR 1 -00.O i 2015 5 / 13 Obecný koncept krystalografie - terminologie Do následující tabulky doplňte odpovídající protipól: Prvek Krystal(Direct) FT obraz(Reciprocal) Obsah Molekula Dimenze r(XYZ) Funkce Strukturní faktor F(hkl) Vlastnosti Spojitá, reálná hkl reciprocal Obecný koncept krystalografie - terminologie Do následující tabulky doplňte odpovídající protipól: Prvek Krystal(Direct) FT obraz(Reciprocal) Obsah Molekula Difrakční obrazec Dimenze r(XYZ) S(hkl) Funkce P(r) Strukturní faktor F(hkl) Vlastnosti Spojitá, reálná Diskrétní, komplexní hkl reciprocal Amplituda a fáze Amplituda rozptýleného záření závisí na Fáze rozptýleného záření závisí na ... fhkl = f.^Hhxj + kyj+lzj) Im Re 1 -00.O i 2015 7 / 13 Amplituda a fáze Amplituda rozptýleného záření závisí na Fáze rozptýleného záření závisí na ... fhkl = f.^Hhxj + kyj+lzj) Im Re 1 -00.O i 2015 7 / 13 SAXS Výpočetní úloha č. 1 Určete vlnovou délku paprsku neutronů, které jsou v termodynamické rovnováze s okolím o teplotě 373 K. hodnoty potřebných konstant: 1,38.10~23; 1,68-10~27; 6,63.10~3A J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 9 / 13 Výpočetní úloha č. 1 Určete vlnovou délku paprsku neutronů, které jsou v termodynamické rovnováze s okolím o teplotě 373 K. hodnoty potřebných konstant: 1,38.10~23; 1,68-10~27; 6,63.10~3A Řešení X-- 2m IkmT 0.22 nm J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 9 / 13 Výpočetní úloha č. 2 Protein globulin izolovaný z tabákových semen krystaluje v plošně centrované kubické soustavě o mřížkovém parametru 12.3 nm a hustotě 1.287 g.cm 3. Jaká je jeho molekulová hmotnost. J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 10 / 13 Výpočetní úloha č. 2 Protein globulin izolovaný z tabákových semen krystaluje v plošně centrované kubické soustavě o mřížkovém parametru 12.3 nm a hustotě 1.287 g.cm 3. Jaká je jeho molekulová hmotnost. Řešení A/ = 8*| + 6*| = 4 M — _P^L — 1287.(12,3.10-9)3 _ o 5 ,D lvi m — Nmu — 4.ij66.10 - 27 — 30 KUa J. Novotný □ ► 4 S> 30. září 2015 10 / 13 Výpočetní úloha č. 3 Výpočetní úloha č. 3 Vypočtěte fázi rozptýleného záření pro body zadané v 2D mřížce s vyznačenými Braggovými rovinami. X Řešení eŕ<ŕl = e' .27r(ŕcxi+/yi) = e' .2tt(3. f+2.0) _ eí47r _ ]_ e'^2 = e' .2-K(kx2+ly2) = e' .27r(3.i+2.i) = eí37r = eŕ<ŕ3 J e' .27r(ŕcx3+/y3) = e' .27r(3.0+2.i) _ ei2-K _ ]_ 30. září 2015 11 / 13 Použitá a doporučená literatura http: //dasher.wustl.edu/bio5357/reading/eisenberg-xray-79.pdf R.M. Sweet: Fundamentals of Crystallography P. Atkins, J. de Paula: Physical Chemistry D» HMD 1 0<*0 30. září 2015 12 / 13 Příště: Mgr. M. Novák - Mezimolekulové interakce 1 -00.O i 2015 13 / 13