Luminiscenční metody Metody biofyzikálni chemie - seminář (C5856) Jan Novotný novotnyj an@mail.muni.cz 14. října 2015 J. Novotný 14. října 2015 1/12 Energetický digram Doplňte diagram a srovnejte děje podle parametrů v přiložené tabulce: Děj časová škála k vs. kvit, pořadí A Absorpce Fluorescence Fosforescence J. Novotný 14. října 2015 2 / 12 Energetický digram Doplňte diagram a srovnejte děje podle parametrů v přiložené tabulce: S2 Internal I Conversion j_ Absorption hvA^ Intersystem Irossing_ Fluorescence hvp«1 Phosphorescence Děj časová škála k vs. kv;b pořadí Xmax Absorpce 10_15s 1 Fluorescence 10_9s < 2 Fosforescence 10°s < 3 J. Novotný 14. října 2015 2 / 12 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. J. Novotný Ant < = = > š -O Q, O 14. října 2015 3 / 12 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. J. Novotný 14. října 2015 3 / 12 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. O Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostredí. J. Novotný 14. října 2015 3 / 12 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. Q Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. O Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostředí. Q Příčinou Stokesova posunu je nezářivá vibrační relaxace. J. Novotný 14. října 2015 3 / 12 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. Q Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. O Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostředí. Q Příčinou Stokesova posunu je nezářivá vibrační relaxace. O Totožné fluorescenční spektrum je pozorováno nezávisle na vlnové délce excitačního záření. J. Novotný 14. října 2015 3 / 12 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. Q Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. O Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostředí. Q Příčinou Stokesova posunu je nezářivá vibrační relaxace. O Totožné fluorescenční spektrum je pozorováno nezávisle na vlnové délce excitačního záření. Q Resonanční přenos energie (RET, FRET) předpokládá reabsorpci fotonu mezi donorem a akceptorem. J. Novotný 14. října 2015 3 / 12 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. Q Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. O Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostředí. Q Příčinou Stokesova posunu je nezářivá vibrační relaxace. O Totožné fluorescenční spektrum je pozorováno nezávisle na vlnové délce excitačního záření. Q Resonanční přenos energie (RET, FRET) předpokládá reabsorpci fotonu mezi donorem a akceptorem. O Doba života fluorescence závisí nepřímo úměrně na sumě rychlostních konstant zářivých i nezářivých dějů. J. Novotný 14. října 2015 3 / 12 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. Q Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. O Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostředí. Q Příčinou Stokesova posunu je nezářivá vibrační relaxace. O Totožné fluorescenční spektrum je pozorováno nezávisle na vlnové délce excitačního záření. Q Resonanční přenos energie (RET, FRET) předpokládá reabsorpci fotonu mezi donorem a akceptorem. O Doba života fluorescence závisí nepřímo úměrně na sumě rychlostních konstant zářivých i nezářivých dějů. O Pro měření anizotropie emisního signálu se používá cirkulárně polarizovaného excitačního záření. J. Novotný 14. října 2015 3 / 12 Úloha 1 Ke strukturám uvedených fluorescenčních sond přiřaďte zkratky a biochemickou aplikaci DAPI, ddATP-Dye, DPH, TNS J. Novotný 14. října 2015 4 / 12 Úloha 1 Ke strukturám uvedených fluorescenčních sond přiřaďte zkratky a biochemickou aplikaci TNS ddATP-dye proteiny sekvencování DAPI, ddATP-Dye, DPH, TNS J. Novotný 14. října 2015 4 / 12 Úloha 2: Fluorescenční metody Přiřaďte vhodnou strategii využívající fluorescenční spektroskopie k následujícím úlohám: A) Měření hydrodynamického poloměru proteinu. B) DNA hybridizace. C) Lokalizace Trp residua (na povrchu či v nitru proteinu). D) Zastoupení nenasycených mastných kyselin v biomembráně. E) Určení asociační konstanty dimerizace eosinu. J. Novotný 14. října 2015 5 / 12 Úloha 2: Fluorescenční metody Přiřaďte vhodnou strategii využívající fluorescenční spektroskopie k následujícím úlohám: A) Měření hydrodynamického poloměru proteinu, anizotropie značky-korelační čas B) DNA hybridizace. FRET C) Lokalizace Trp residua (na povrchu či v nitru proteinu), zhášení, Stokesův posun D) Zastoupení nenasycených mastných kyselin v biomembráně. viskozita-anizotropie DPH E) Určení asociační konstanty dimerizace eosinu. emise excimeru J. Novotný 14. října 2015 5 / 12 Úloha 3: FREI Pokuste se interpretovat fluorescenční experiment provedený na komplexu proteinkinázy tvorené dvěma katalytickými (C) a dvěma receptorovými jednotkami (R). Obě jednotky jsou označeny fluorescenčními značkami: jednotka C fluoresceinem (Fl) a jednotka R rhodaminem (Rh). V nativní formě R2C2 lze detekovat FRET. Určete směr přenosu a vysvětlete vliv přídavku cAMP a inhibitoru PKI na podobu spektra. J. Novotný 14. října 2015 6 / 12 Úloha 3: FREI Pokuste se interpretovat fluorescenční experiment provedený na komplexu proteinkinázy tvorené dvěma katalytickými (C) a dvěma receptorovými jednotkami (R). Obě jednotky jsou označeny fluorescenčními značkami: jednotka C fluoresceinem (Fl) a jednotka R rhodaminem (Rh). V nativní formě R2C2 lze detekovat FRET. Určete směr přenosu a vysvětlete vliv přídavku cAMP a inhibitoru PKI na podobu spektra. J. Novotný 14. října 2015 6 / 12 Úloha 4: Kinetické parametry fluorescence Eosinový flourofor je charakterizován kvantovým výtěžkem 0.65 a dobou života fluorescence 3.1 ns. Vypočtěte rychlostní konstantu zářivého, nezářivého přechodu a vlastní dobu života fluorescence. J. Novotný 14. října 2015 7 / 12 Úloha 4: Kinetické parametry fluorescence Eosinový flourofor je charakterizován kvantovým výtěžkem 0.65 a dobou života fluorescence 3.1 ns. Vypočtěte rychlostní konstantu zářivého, nezářivého přechodu a vlastní dobu života fluorescence. Řešení _ O = r ^ r+/w • r _ r+/w T Rychlostní i- 0.65 1 3.1 konstanty: 0.21 ns~\ knr = 1 ľ = 3\ 0.21 = 0.11 ns-1 J. Novotný 14. října 2015 7 / 12 Úloha 5: Perrinova rovnice Za předpokladu exponenciálního poklesu intenzity /(ŕ) a anizotropie r(t) fluorescenčního signálu odvoďte vztah mezi anizotropií r, dobou života r a rotačním korelačním časem 9. Při výpočtu vyjděte z definice časově váženého průměru anizotropie r: J0°° r(t)l(t)át ľ ~ /~ /(t)dt J. Novotný 14. října 2015 8 / 12 Úloha 5: Perrinova rovnice Za předpokladu exponenciálního poklesu intenzity /(ŕ) a anizotropie r(t) fluorescenčního signálu odvoďte vztah mezi anizotropií r, dobou života r a rotačním korelačním časem 9. Při výpočtu vyjděte z definice časově váženého průměru anizotropie r: r = J0°° r(t)l(t)át Jo°° Kt)dt l = he r = r0e e r = /pro J~e ŕ(' + ^)dŕ _ r0(l + l) 1 /o/0°°e rdt J. Novotný 14. října 2015 8 / 12 Úloha 6: FRET Lidský sérový albumin obsahuje jediné Trp residuum na pozici 214. Vzorek byl kovalentně označen na Cys 34 athranilovým fluoroforem. Fôrsterova vzdálenost Rq pro FRET přenos z Trp na anthranoyl je 30.3Ä. Za použití emisního spektra vypočtěte vzdálenost mezi oběma aminokyselinami v molekule. Pro rychlostní konstantu rezonančního přenosu platí = _!_ = _!_ = r v+kRET r+r(^)6 Ro+r6 Kvantový výtěžek 0 pro vlnovou délku 340 nm: emise albuminu s akceptorem/emise volného albuminu=0.2/0.55 0 = 0.364 = r = ^4 = 27.6Á óv.ó -tr 1.756 --J J. Novotný Úloha 6: Dipolárnŕ interakce - test orientační závislosti Efektivita rezonančního přenosu závisí kromě spektrálního překryvu donoru a akceptoru na vzdálenosti a vzájemné orientaci přechodových momentů. Tyto momenty interagují jako dva dipóly podle angulárního vztahu: Ha-Hb ~ 3(/M.r)(/i£>.r) Vypočtěte hodnotu orientačního faktoru k2 pro přiložený model. Í ,-""1 J. Novotný 14. října 2015 10 / 12 Úloha 6: Dipolárnŕ interakce - test orientační závislosti Efektivita rezonančního přenosu závisí kromě spektrálního překryvu donoru a akceptoru na vzdálenosti a vzájemné orientaci přechodových momentů. Tyto momenty interagují jako dva dipóly podle angulárního vztahu: Ha-Hb ~ 3(/M.r)(/i£>.r) Vypočtěte hodnotu orientačního faktoru k2 pro přiložený model. J. Novotný 14. října 2015 10 / 12 Použitá a doporučená literatura Joseph R. Lakowicz: Principles of Fluorescence Spectroscopy Jihad Rene Albani: Principles and Applications of Fluorescence Spectroscopy P. Atkins, J. de Paula: Physical Chemistry J. Novotný 14. října 2015 11 / 12 Příště: - UV-VIS Absorpční spektroskopie J. Novotný 14. října 20