UV-VIS absorpční metody Metody biofyzikálni chemie - seminář (C5856) Jan Novotný novotnyj an@mail.muni.cz 21. října 205 J. Novotný 21. října 205 1 / 15 Spektroskopické metody - kontext Doplňte údaje v přiložené tabulce: Spektrální oblast Pozorovaný děj Příklad metody X-rays UV-VIS IR MW RW J. Novotný 21. října 205 2 / 15 Spektroskopické metody - kontext Doplňte údaje v přiložené tabulce: Spektrální oblast Pozorovaný děj Příklad metody X-rays přechody vnitřních e- absorpce, difrakce, SAXS UV-VIS valenční e- absorpce, CD, luminiscence IR molekulární vibrace IC spektroskopie, Ramanův rozptyl MW přechody e_ spinu, molekulární rotace EPR, rotační spektroskopie RW přechody jaderného spinu NMR J. Novotný 21. října 205 2 / 15 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. J. Novotný 21. října 205 3 / 15 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. J. Novotný 21. října 205 3 / 15 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Franck-Condonův faktor odpovídá překryvovému integrálu vibrační funkce v základním a excitovaném stavu. J. Novotný 21. října 205 3 / 15 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Franck-Condonův faktor odpovídá překryvovému integrálu vibrační funkce v základním a excitovaném stavu. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou zakázané J. Novotný 21. října 205 3 / 15 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Franck-Condonův faktor odpovídá překryvovému integrálu vibrační funkce v základním a excitovaném stavu. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou zakázané O Počet normálních vibračních módů N-methylacetamidu je 12. J. Novotný 21. října 205 3 / 15 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Franck-Condonův faktor odpovídá překryvovému integrálu vibrační funkce v základním a excitovaném stavu. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou zakázané O Počet normálních vibračních módů N-methylacetamidu je 12. Q Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. J. Novotný 21. října 205 3 / 15 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Franck-Condonův faktor odpovídá překryvovému integrálu vibrační funkce v základním a excitovaném stavu. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou zakázané O Počet normálních vibračních módů N-methylacetamidu je 12. O Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. O Ve spektru chlorofylu nalezneme dvě maxima: 450nm a 700nm. J. Novotný 21. října 205 3 / 15 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Franck-Condonův faktor odpovídá překryvovému integrálu vibrační funkce v základním a excitovaném stavu. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou zakázané O Počet normálních vibračních módů N-methylacetamidu je 12. O Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. O Ve spektru chlorofylu nalezneme dvě maxima: 450nm a 700nm. O Měření elektronových přechodů v plynné fázi umožňuje sledovat rozlišení absorpčních pásů na jednotlivé vibrační přechody. J. Novotný 21. října 205 3 / 15 Úloha 1 Ke strukturám uvedených látek přiřaďte název, biochemickou úlohu a typ elektronového přechodu: J. Novotný 21. října 205 4 / 15 Úloha 1 Ke strukturám uvedených látek přiřaďte název, biochemickou úlohu a typ elektronového přechodu: hem - hemoglobin, myoglobin J. Novotný 21. října 205 4 / 15 Úloha 2: Konjugace Která z uvedených sloučenin bude absorbovat při vyšší vlnové délce a proč? J. Novotný 21. října 205 5 / 15 Úloha 2: Konjugace Která z uvedených sloučenin bude absorbovat při vyšší vlnové délce a proč? S délkou konjugovaného systému klesá H 0 M 0-L UMO gap a narůstá A J. Novotný 21. října 205 5 / 15 Úloha 3: Vliv pH na absorpční spektrum Pokuste se přiřadit velikost extinkčního koeficientu a absorpčního maxima pro tyrosin při pH < pKa a pH > pKa. Své tvrzení zdůvodněte. Alle1 = 270nm, 1450 A2,e2 = 287nm, 2600 J. Novotný 21. října 205 6 / 15 Úloha 3: Vliv pH na absorpční spektrum Pokuste se přiřadit velikost extinkčního koeficientu a absorpčního maxima pro tyrosin při pH < pKa a pH > pKa. Své tvrzení zdůvodněte. Au ex = 270nm, 1450 -OH pH < pKa A2le2 = 287nm, 2600 -0~ =>• pH > pKa J. Novotný 21. října 205 6 / 15 Úloha 4: Vliv solvatace na absorpční spektrum Přiložené absorpční spektrum tyrosinu ukazuje vliv přídavku ethylen glykolu o koncentraci 15%. Interpretujte pomocí hladinového modelu pozorování. e 250 260 270 280 290 300 \ (nm) J. Novotný 21. října 205 7 / 15 Úloha 4: Vliv solvatace na absorpční spektrum Přiložené absorpční spektrum tyrosinu ukazuje vliv přídavku ethylen glykolu o koncentraci 15%. Interpretujte pomocí hladinového modelu pozorování. e 250 260 270 280 290 300 \ (nm) Bathochromní, Hyperchromní posun. Obecně pokles polarity prostředí destabilizuje 7r* (blueshift 7T —>• 7T*) a destabilizuje n (redshift n —> 7r*) J. Novotný 21. října 205 7 / 15 Úloha 5: Retinal Na obrázku je znázorněna struktura zrakového pigmentu retinalu. Identifikujte HOMO a LUMO orbitaly (levý sloupec). Pokuste se odhadnout jaky efekt má vazba kvartemího dusíku na hodnotu Xmax. Na základě analýzy diferenční elektronové hustoty (pravý sloupec) ukažte orientaci tranzitního dipólového momentu. Top view Side view M. Mohseni, Y. Omar, G. S. Engel, M. B. Plenio: Quantum effects in biology J. Novotný 21. října 205 8 / 15 Úloha 6: Cirkulární dichroismus V CD spektroskopii se užívá několik veličin charakterizujících interakci polarizovaného záření s chirálním médiem. Doplňte fyzikální vztah a rozměr. Optická rotační disperze Cirkulární dichroismus Elipticita e\ J. Novotný 21. října 205 9 / 15 Úloha 6: Cirkulární dichroismus V CD spektroskopii se užívá několik veličin charakterizujících interakci polarizovaného záření s chirálním médiem. Doplňte fyzikální vztah a rozměr. Optická rotační disperze ip = ^y^(n/ - - np) [rad] Cirkulární dichroismus Ae = £/ - - ep [M 1cm x] J. Novotný 21. října 205 9 / 15 Úloha 7: Lambert-Beerův zákon Molární extinkční koeficient roztoku při 540 nm je 268 dm3mol_1cm_1. Při průchodu světla o uvedené vlnové délce roztokem o optické délce 7.5 mm došlo k absorpci 52.3% intenzity. Jaká byla koncentrace rozpuštěné látky? J. Novotný 21. října 205 10 / 15 Úloha 7: Lambert-Beerův zákon Molární extinkční koeficient roztoku při 540 nm je 268 dm3mol_1cm_1. Při průchodu světla o uvedené vlnové délce roztokem o optické délce 7.5 mm došlo k absorpci 52.3% intenzity. Jaká byla koncentrace rozpuštěné látky? Řešení A = log/ lQg 0.477 out 1 A = e.c.l 0.321 e.l 298,0.75 1.6 mM J. Novotný 21. října 205 10 / 15 Úloha 8: Monitorování konverze pomocí UV-VIS spektra Na obrázku je záznam VIS-spektra bromthymolové modři v závislosti na měnícím se pH. a) Jak se nazývá bod ve spektru označený hvězdičkou a jakou vlastností se vyznačuje? b) K absorpčním maximům přiřaďte entity Hind a lnd~. c) Vyjádřete poměr konjugované kyseliny a báze pomocí aktuálních hodnot absorbancí A(Ai), A(A2) a jejich limitních hodnot A(Ai)max a A(A2)max- 350 400 450 500 550 Wavelength, n m 600 550 700 J. Novotný 21. října 205 11 / 15 Úloha 8: Monitorování konverze pomocí UV-VIS spektra Na obrázku je záznam VIS-spektra bromthymolové modři v závislosti na měnícím se pH. a) Jak se nazývá bod ve spektru označený hvězdičkou a jakou vlastností se vyznačuje? b) K absorpčním maximům přiřaďte entity Hind a lnd~. c) Vyjádřete poměr konjugované kyseliny a báze pomocí aktuálních hodnot absorbancí A(Ai), A(A2) a jejich limitních hodnot A(Ai)max a A(A2)max- Řešení 350 400 450 500 550 Wavelength, n m 600 550 700 J. Novotný a) isosbestický bod: e(Hlnd)\* b) Hind Ai = 430nm, lnd~ X2 e(lnd )A, 620nm c) [Hind] = A(X1).A(X2)max [lnd~] A(X2).A(X1)max 21. října 205 11 / 15 Úloha 9: Výpočet tranzitního momentu Uvažme konjugovaný systém 7r-elektronů popsaný vlnovou funkcí částice v jednorozměrné potenciálové jámě.A) Ukažte, jak se energie excitace mění s délkou jámy. B) Odvoďte analyticky i graficky, že pravděpodobnost přechodu n = 1 —>> 2 je nenulová na rozdíl od n = 1 —>> 3. Nápověda: Vlastní stacionární funkce elektronu v potenciálové jámě o délce L má tvar ipn = Asm^x J. Novotný 21. října 205 12 / 15 Úloha 9: Výpočet tranzitního momentu Uvažme konjugovaný systém 7r-elektronů popsaný vlnovou funkcí částice v jednorozměrné potenciálové jámě.A) Ukažte, jak se energie excitace mění s délkou jámy. B) Odvoďte analyticky i graficky, že pravděpodobnost přechodu n = 1 —>> 2 je nenulová na rozdíl od n = 1 —>> 3. Nápověda: Vlastní stacionární funkce elektronu v potenciálové jámě o délce L má tvar ipn = Asm^x Řešení A=l/l//0tsm2Yxdx=Y/f En = # f0L 2m L2 h M 0 sin Zfx (- h2 Ql 2 m dx2 sin TT.n xdx = sin^xdx = L 2 m L2 = eA2 /0L 2 = eA2 LL -1 7T .1 * 7T .2 sm^x.x.sm Ml 'O sm L l^xdx = 1 g*u*u=g x.x.sm^xdx = 0 g*u*g=u 7T.1 „ „ „:„ 7T.3 sina.sin/3 = ^[cos(a — (3) — cos(a + /3)] f x.cosax = -sinax + -^-cosax ŕ o ....--V"" x - dipól m ¥1 -¥2 ¥1>2 oment ---------- / ______________ x - dipól m ¥1 ¥3 - ¥1 V3 — oment ---------- J. Novotný 21. října 205 12 / 15 Úloha 10: Frank-Condonův faktor Základní stav hypotetické molekuly je popsán vibrační vlnovou funkcí /Vo.e-a(x-x°) . Vypočítejte Franck-Condonův faktor pro přechod do stavu /Vi.e"a(x-X1)2. J. Novotný 21. října 205 13 / 15 Použitá a doporučená literatura Franz-Xaver Schmid: Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry M. Mohseni, Y. Omar, G. S. Engel, M. B. Plenio: Quantum effects in biology P. Atkins, J. de Paula: Physical Chemistry http://www.cyut.edu.tw/wjchien/BiopolymerSpect/text/absorption.pdf J. Novotný 21. října 205 14 / 15 Příště: Molekulová dynamika biomolekul J. Novotný 21. října 205 15 / 15