NMR Spektroskopie Metody biofyzikálni chemie - seminář (C5856) Martin Novák 323460@mail.muni.cz 18. listopadu 2015 M. Novák 18. listopadu 2015 1/16 Interakce jaderného spinového momentu - kontext Doplňte k zadaným interakčním mechanismům symbolické znázornění a příslušný Hamiltonián: Dipol-dipolová interakce Chemický posun Nepřímá spin-spinová interakce XX XX H; = -jJL.Bind oc 7,7z.cr.8o U „ 7/7/(3cos tp-1) 7 ? XX XX XX H,j oc 2ttJ.Ij.Ij M. Novák 18. listopadu 2015 2 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. M. Novák 18. listopadu 2015 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. M. Novák 18. listopadu 2015 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí M. Novák 18. listopadu 2015 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná Bq. M. Novák 18. listopadu 2015 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná 6o- O Rezonanční signál ovlivněný pomalou výměnou vzhledem k NMR časové škále se projevuje ve spektru rozšírením a polohou rezonanční linie odpovídající váženému průměru chemických posunů limitních stavů. M. Novák 18. listopadu 2015 3 / 16 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná 6o- O Rezonanční signál ovlivněný pomalou výměnou vzhledem k NMR časové škále se projevuje ve spektru rozšírením a polohou rezonanční linie odpovídající váženému průměru chemických posunů limitních stavů. O NMR spektrum proteinu s malým stupněm strukturovanosti(foldu) se vyznačuje úzkými signály a malou disperzí. M. Novák 18. listopadu 2015 3 / 16 Úloha 1: Chemický posun - identifikace aminokyselin Pro daná 13 C N MR spektra určete, jaké aromatické aminokyselině náleží a proč. 1 so 1^0 ' 140 120 ' 100 ' s'o g'o 40 20 0 PPM HO H NHj H O CH2 \ / phenylalanine iéo ' iéo Uo 1 120 ' ióo so 1 eo 40 1 20 HO H NH2 O CH, -OH tyrosine ppm I. Novák 18. listopadu 2015 4 / 16 Úloha 2: Chemický posun - rozlišení Pro dané systémy, rozhodněte, který z dvojice označených atomů bude mít vyšší hodnotou chemického posunu: M. Novák 18. listopadu 2015 5 / 16 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3J-coupling). • Kvalitativní pohled: Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. H • Kvantitativní pohleď. K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti úhlu /3 : C4' C4' 18. listopadu 2015 6 / 16 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3J-coupling). • Kvalitativní pohled: Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. // v/ • Kvantitativní pohled: K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti úhlu /3 : C4' C4' 18. listopadu 2015 6 / 16 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3 J-coupling). • Kvalitativní pohled: Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. // \s • Kvantitativní pohled: K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti úhlu /3 : P = -60° p = 180° gauche anti C4' C4' 18. listopadu 2015 6 / 16 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby Pomocí přiloženého ID H NMR spektra odhadněte poměr a a j3 izomeru v roztoku D-glukopyranozy naměřeném v D2O. M. Novák 18. listopadu 2015 7 / 16 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby Pomocí přiloženého ID H NMR spektra odhadněte poměr a a j3 izomeru v roztoku D-glukopyranozy naměřeném v D2O. 3.0 6 M. Novák 18. listopadu 2015 7 / 16 Úloha 4: Příklady biochemických aplikací K uvedeným problémům strukturní analýzy přiřaďte odpovídající techniku: Potlačení dipol-dipolové relaxace u proteinu Rozlišení intra- a intermolekulárních kontaktů v komplexu ligand-receptor Odstranění signálů labilních protonů v molekule nukleové kyseliny Přiřazení málo rozlišených signálů v nestrukturované části proteinu Mapování reziduí směřujících k povrchu proteinu Převedení vzorku do D2O 13C editované NOESY spektrum Exprese proteinu v deuterovaném médiu Aplikace paramagnetických sond Multidimenzionální inverzní experimenty (4D, 5D) M. Novák 18. listopadu 2015 8 / 16 Úloha 4: Příklady biochemických aplikací K uvedeným problémům strukturní analýzy přiřaďte odpovídající techniku: Potlačení dipol-dipolové relaxace u proteinu Rozlišení intra- a intermolekulárních kontaktů v komplexu ligand-receptor Odstranění signálů labilních protonů v molekule nukleové kyseliny Přiřazení málo rozlišených signálů v nestrukturované části proteinu Mapování reziduí směřujících k povrchu proteinu exprese proteinu v deuterovaném médiu C editované NOESY spektrum převedení vzorku do D2O multidimenzionální inverzní experimenty (4D, 5D) exprese proteinu v deuterovaném médiu M. Novák 18. listopadu 2015 8 / 16 Úloha 5: Protein vs. Nukleové kyseliny: NMR aspekty Diskutujte o následujících praktických okolností NMR experimentů při srovnání protein a DNA/RNA: Syntéza vzorku Izotopické značení Hustota 1H Sekvenční přiřazení Restrainy pro určení struktury Proteiny NA 18. listopadu 2015 9/16 Úloha 5: Protein vs. Nukleové kyseliny: NMR aspekty Diskutujte o následujících praktických okolností NMR experimentů při srovnání protein a DNA/RNA: Proteiny NA Syntéza vzorku in vivo chemickou cestou Izotopické značení snadné nákladné Hustota 1H rel. vysoká nizsi Sekvenční přiřazení through bond J-coupling through space NOE Restrainy pro určení struktury 5: alfa vs. beta, NOE, RDC mj. NOE, RDC, J-Q -J coupling(riboza), P M. Novák 18. listopadu 2015 9 / 16 Úloha 6: Sekvenční přirazení peptidu Pomocí fiktivních výsledků (strip-plotu) 3D NMR experimentů (HNCA, určete N—»C sekvenci hypotetického peptidu: 0-1) H\ CO 'a Q -N- 'a R O R (g) (Q) N Q T M. Novák 18. listopadu 2015 10 / 16 Úloha 6: Sekvenční přirazení peptidu Pomocí fiktivních výsledků (strip-plotu) 3D NMR experimentů (HNCA, určete N—»C sekvenci hypotetického peptidu: 0-1) H\ CO 'a Q -N- 'a R O R (O) N Q M. Novák 18. listopadu 2015 10 / 16 Úloha 7: Časová škála interakce ligand-receptor Charakterizujte přiložená 15N-1H HSQC spektra zobrazující titrační experiment pomocí pojmů: rychlá, střední a pomalá výměna: i L0.3 9.3 9.3 •i' 200 (j,M protein +100 (j,M ligand (1:2) +300 (j,M ligand (3:2) +900 (J.M ligand (9:2) I 200 (j,M protein +100 (J.M ligand (1:2) +300 (j,M ligand (3:2) +900 (j,M ligand (9:2) +2700 (j,M ligand (27:2) M. Novák 18. listopadu 2015 11 / 16 Úloha 8: Populace jaderného spinu Vypočtěte rozdíl v populaci izolovaných jaderných spinu a - j3 pro atom 1H (magnetogyrická konstanta 7 = 2.68.1087_1s_1) v magnetickém poli 11.7 T a teplotě 298 K. M. Novák 18. listopadu 2015 12 / 16 Úloha 8: Populace jaderného spinu Vypočtěte rozdíl v populaci izolovaných jaderných spinu a - (3 pro atom 1H (magnetogyrická konstanta 7 = 2.68.1087~_1s_1) v magnetickém poli 11.7 T a teplotě 298 K. Řešení AE = Ep - E ■a. hhj = fry 60 A/ N, * =e" OL kr = e hi Bp kT = 0.999919 1QQQQQ 100008 M. Novák 18. listopadu 2015 12 / 16 Úloha 9: Nukleární Overhauserův efekt Uvažujme zjednodušený NOE experiment provedený na malém proteinu. Krátkým ozařováním o délce 25 ms saturujeme populaci spinu H/3 a okamžitě měříme signál blízkého spinu H7 v leucinu - za podmínky aproximace počátečního stavu (ŕ 0). Ukažte, jak se za těchto podmínek zjednoduší kinetická rovnice prvního řádu popisující časový vývoj magnetizace spinu H7 v závislosti na auto-relaxaci (rychlostní konstanta p) a cross-relaxaci (a): ^ = -p[/7-/7(0)]-a[/^-//3(0)] Jaká je přibližná vzdálenost atomů H/3 a H7, jestliže jsme při tomto experimentu pozorovali změnu signálu v důsledku NOE o velikosti -0.04 a pro referenční vzdálenost atomů H/?i - H/?2 1.75Á bylo naměřeno NOE -0.3? M. Novák 18. listopadu 2015 13 / 16 Úloha 9: Nukleární Overhauserův efekt Uvažujme zjednodušený NOE experiment provedený na malém proteinu. Krátkým ozařováním o délce 25 ms saturujeme populaci spinu H/3 a okamžitě měříme signál blízkého spinu H7 v leucinu - za podmínky aproximace počátečního stavu (ŕ 0). Ukažte, jak se za těchto podmínek zjednoduší kinetická rovnice prvního řádu popisující časový vývoj magnetizace spinu H7 v závislosti na auto-relaxaci (rychlostní konstanta p) a cross-relaxaci (a): dl. 1 dt -p[/7-/7(0)]-(7[/ŕ-/ŕ(0)] Jaká je přibližná vzdálenost atomů H/3 a H7, jestliže jsme při tomto experimentu pozorovali změnu signálu v důsledku NOE o velikosti -0.04 a pro referenční vzdálenost atomů H/?i - H/?2 1.75Á bylo naměřeno NOE -0.3? Řešení dl, 7 dt r^o = -p['j(0) ~ /7(0)] + <7lp{0) = <7lp{0) /7 = <7lp{0)t NOE, 1-13 NOE /31-/32 /31-/32 6 7-/3 r: Q = 1.756^M = 2.44Ä .6 7-/3 -0.04 I. Novák 18. listopadu 2015 13 / 16 Úloha 10: Určování vazebné konstanty Pomocí NMR titrace lze určit vazebnou konstantu např. interakce enzym-inhibitor: E 4- / <=: El K — ^ V případě rychlé výměny pozorujeme posun zprůměrovaného signálu inhibitoru v závislosti na poměru volné a vázané formy inhibitoru(//, Íei). Ukažte, čemu se rovná směrnice a průsečík lineární závislosti počáteční koncentrace inhibitoru na změně chemického posunu [/]o oc Si — č/(0), pokud je počáteční koncentrace inhibitoru mnohem větší než koncentrace enzymu. Použitá a doporučená literatura http: //bou man. chem.georgetown.edu/nmr/dipolar/di polar, htm I http://groups.chem.u be. ca/stra us/12, pdf http://www.col urn bia.edu/itc/chemistry/chem-cl403/lectures/Fal 12005/ http: //otter, biochem.u be.ca/publications/BcX_Tyrosine_J BNMR_2011.pdf P. Atkins, J. de Paula: Physical Chemistry M. Novák 18. listopadu 2015 15 / 16 Příště: Biosenzory a jejich aplikace I. Novák 18. listopadu 2015 16 / 16