ododooodododo dodododododod ododododododo dodododododod o d o d o " " " o d o □ o
MASARYKOVA UNIVERZITA
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ODODOuvyuODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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□ O O d
□ O O d d O O □
□ O O d d O O d d O O □
□ O
Design sekvence PCR primerů
Hana Konečná
CEITEC - MU
Centrální laboratoř - Proteomika
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
^^^j i ministerstvo školství,
EVROPSKÁ UNIE        ^0 ■ mládeže a tělovýchovy
T7T,
£_|
OP Vzdělávání pro konkurenceschopnost
(Ml
INVESTICE  DO  ROZVOJE VZDELÁVANÍ
onononononono nonononononon onononononono nonononononon o □ o □ o       " o □ o □ o
ODODOuv^uODOOO □ ODODODODODOD
ononoaononono
I IMJ ^  MASARYKOVA UNIVERZITA
definice
aplikace
modifikace
syntéza
purifikace
kontrola kvality
OLIGONUKLEOTIDY
design sekvence zásady navrhování software OLIGO 7 praktická ukázka
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
ministerstvo školství, MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY
EVROPSKÁ UNIE H
INVESTICE  DO  ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
OP Vzdělávání pra konkurenceschopnost
(Ml
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
ODODODODODODO
oligonukleotid
krátká jednořetězcová struktura DNA nebo RNA (event. PNA) hydroxyl na obou koncích (normálně na 5'- konci fosfát)
oligonukleotid
syntetický oligonukleotid
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
orientace! polymeráza!
5' end
3' and
r
O H "O—P=0
H2C5-
O H
O—P=0
H2i:
CH H
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
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ODODODODODODO
Aplikace syntetických oligonukleotidů
• primery pro syntézu komplementární DNA
PCR, Real-Time PC R
• syntéza genů a rekombinantní proteiny
• hybridizační sondy pro klonování
• místně cílená mutageneza
• sekvenování a genetické profilování
• diagnostika - testy a biosensory
• gene arrays
• blokace genové exprese antisense oligo
• potenciální léčiva a DNA vakcíny
• NMR studia interakcí DNA-protein
• strukturální rentgenová analýza NA
-
oodododododod ododododododo
□ OdOdOdOdOdOd ododooodododo
□ odododododod
(X.
9
-0-d = 0
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ododododododo
ododododododo
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ododododododo dodododododod ododododododo
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ODODODODODODO
Degenerované oligonukleotidy
Příklady:
ACG TAC GTA CGT ACG TAC nedegenerovaný
ACG TAM GTA CGT ACG TAC M = A/C
ACG TAC GTA CDT ACG TAC D = A/G/T
ACG TAC GTA CGT ACG NAC N = A/C/G/T
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
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o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
ododododododo
Degenerované oligonukleotidy
2-deoxyinosin
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod
M	A or C
R	A or G
W	A or T
S	C or G
Y	C or T
K	G or T
V	A or C or G
H	A or C or T
D	A or G or T
B	C or G or T
N	G or A or T or C
X	G or A or T or C
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
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ooononononono
Modifikace na 5'- konci
postsyntetické modifikace
sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR
□ OdodododOdOo odododooododo
□ ODODODOnonon
ODODODODODODO
□ODODODOnonon
5'
fosforylace
aminoskupina
thioskupina
digoxigenin
biotin
enzymy
psoralen
akridin
cholesterol
fluoresc. barviva
zhášedla
2,4-dinitrofenyl
TBR-chelát
spacer
větvení
blokáda
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
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Modifikace na 3'- konci
3'
derivatizovaná matrice fosfát
thioskupina —* aminoskupina spacer akridin —- biotin —► fluorescbarviva —- zhášedla cholesterol 2,4-dinitrofenyl
ododododododo
□ odododododod
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ odododododod ododododododo
Real-Time PCR
• 2x značená sonda
• REPORTER
• QUENCHER
FORWARD FRM EH
HEYCn&E P lir/CP
2, Strand displacement: When the probe is intact, the reporter dye emission is quenched.
r i a1
5_9,
ľ ľ
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo □ odododododod
3, Cleavage: During each extension cycle, the DNA polymerase cleaves the reporter dye from the probe.
r-a-
■■-r
-*- B'
4, Polymerization completed: Once separated from the quencher, the reporter dye emits its characteristic fluorescence.
ľ
B'
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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ODODODODODODO
Další modifikace
fosforothioáty     «-páteř
fosforodithioáty
H-fosfonáty
metylfosfonáty
cukr
modifikace v 2'pozici modifikace ribózové jednotky
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
ODODODODODODO DODODODODODOD
ISIÍISISISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
DODODODODODOD ODODODODODODO
Terapeutika
nedegradována nukleázami! modifikace fosfodiesterové vazby
"o i
0 = P
I
o
I
o = p
I
o
CH
phosphorothioate
methylphosphonate phosphoramidate
S
l
CH.
I '
O.
CH.
I '
HX-N 3 I O
0
1
P
i
O
0 = P-BH.
3 -thioformacetal     methylene(methyliminio) boranophosphate
ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod
ooodododododo
□ odododododod
iiiiliiiiiiil     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
□ odododododod ododododododo
antisense oligonukleotid
• oligonukleotid nebo analog
• komplementární k segmentu RNA nebo DNA
• vazbou inhibuje jejich normální funkci
Cell membrane
Antigene (triplex)
dodododododod ododododododo dodododododod
3fe
Ribozyme
RNA
s katalytickou aktivitou
Antisense
ě
Sense/Aptamer
ODODODODODODO DODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
DODODODODODOD ODODODODODODO
Peptidonukleová kyselina pna
nt1 terminal
nenabitá molekula
vazba k DNA/RNA -*&
N-(2-aminoethyl)-glycin
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
Repeat Unit
c-terminal
K I
L V
dna 3'-end
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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Peptidonukleová kyselina
• nenabitá molekula
• vazba k DNA/RNA
pna
dna
. v;
v
B
N-(2-aminoethyl)-glycin
□ ODODODODODOD
ODODODODODODO
□ ODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
dna
ododododododo dodododododod ododododododo
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ododododododo
□ odododododod ododododododo
□ o □ o d o o □ o □ o □
Vlastnosti PNA
• vysoká termostabilita
• Tm nezávisí na obsahu solí
• vyšší specifická
• vyšší afinita
• rezistentní k enzymům...
Gambari R. Expert Qpin Ther Pat. 2014, 24(3):267-94.
Peptide nucleic acids: a review on recent patents and technology transfer.
dodododododod ododododododo dodododododod
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
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LNA
Locked Nucleic Acid
o
2'-0, 4'-C methylenový můstek o=P-0" potlačená flexibilita ribofuranožového kruhu struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace zlepšená hybridizace výjimečná biostabilita
Molecular Therapy (2012); 20 8, 1590-1598.
LNA-based Oligonucleotide Electrotransfer for miRNA Inhibition
ododododododo □ odododododod
onononononono nonononononon Onononononono nonononononon onononononono
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onononononono
OLIGONUKLEOTIDY
design syntéza
purifikace
EXPEDITE 8909
nonononononon onononononono nonononononon onononononono nonononononon
ododododododo □ odododododod ododododododo
□onononoDODOD
ododododododo dodododododod ododododododo
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Syntéza oligonukleotidu
syntéza na pevné fázi od 3'-konce k 5'-konci bezvodé prostředí
o
II
CMj- C — O
	E	í O II	i E O II		
B		-0— p -o o- N	II ~ 0 — p -Q o- N	-OH	B,
Step 3. Capping
- O -
B,
DMT- O
B,'
- O— p -Q
0B "V
Step 4. Oxidation
- o -
Cleavage/Deprotedion
B,
- O— p -Q
on
Step 2. Coupling
- O -
- O -
DMT- O      - O — p _ N(iPr), OH
♦ Tetrezole
ododododododo dodododododod
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
nnnnnnnnnnnno
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ODODODODODODO
VYTEZEK
1.000 0.900 0.800 0.700 0.600 Yield o.500
0.400 0.300 0.200 0.100 0.000
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Efficiency
□ 0.995 ■ 0.990
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PAGE
0    10  20  30 40  50  60  70  80  90 100 Oligonucleotide Length
DODODODODODOD ODODODODODODO
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ododododododo
DESIGN OLIGONUKLEOTIDU
• manuální
• počítačový
www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Oligo_Design/index.h
Hlavní kritéria pro sekvenci PCR primem
• vysoce specifické
• netvoří dimery a vlásenky
• stabilní duplexy s aktivní sekvencí
• nepříliš stabilní 3'-konec
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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ODODODODODODO
OLIGO 6
PCR primery, hybridizační sondy sekvenační primery
OLIGO 7 (od roku 2008)
• TaqMan sondy
• primery pro nested PCR
• molecular beacons
siRNA
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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ODODODODODODO
Terminologie PCR primem
forward primer... část sekvence + vlákna reverse primer... část sekvence - vlákna
pos:
350      tm: 57.1
2Ě0
270
,230
,290
300
,310 ,320
,330
,340
3S0
,360
370
C CTG G CTGTGACTACTCA
hhhhhthhthhhhhhthhhhhhthhhhht
hhhhhhthhtt
TTMTGCCTGGCTGTGACTACKAtTTTTTAAGGATG^
AATTAC G G AC C G AC ACTG ATG AGTG AAAAATTC CTAC C ATAACTC G G ATAC AC C CTTCTACTCTTTTTGTTTG C C C CTC CTG CTAC C GATTAATGTAACTTGTTTGTC GTCTCTG CTTC ACTGGAG
.........ACKÍÍATACACCCTTCTACTC
..............................CCTCCTŮCTACCGATTAA
LMPGCDY5   L   F   K   D   í   I   E   P   M   W   E   DE   KNKRGGR.H ITL|NKQQRR5DL
UPPER - FORWARD - LEFT 5'-►
+ 5'-- 3'-
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
■ 3'
■ 5'
5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	o □	□ o	MASARYKOVA UNIVERZITA	www.muni.cz
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
ODODODODODODO
Terminologie
forward primer... část sekvence + vlákna reverse primer... část sekvence - vlákna
pos:     350      tm: 57.1	
, iíw,          ?73           ?S3           ?33           100        , i3Vř,          l?:>           ^3        , i31<ř,	1Q3 170
	
	
TTAATGttTGGCTGTGACTACKAa 111IAACCATCCTATTGACCCTATCTCCCAACATCACAAAAACAAACGCCCACCACCATCCCTAATTACAT1	"GAACAAACAGCAGAGACGAAGTGAt^C
AATTACGGACCGACACTGATGAGTGAAAAATTCCTACCATAAlITCGGATACACCCTTCTACTCIi i iigtttgcccctcctgctaccgattaatgtaj	KTTGTTTGTC GTCTCTG CTTCACTG GAG
......... ACTCGGATACACCCTTCTACTC	
	
LMPGCDY5LFKDGIEPMWEDEKNIÍRGGRWLITL	NKQQRR5DL
UPPER - FORWARD - LEFT
5' » polymeráza
+ 5] ===| 3'
- 3'-
5'
polymeráza * 5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
□ ODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
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ododododododo
Nasedání PCR primem
pos:     350      tm: 57.1
	, 2S0 _           ?33             100             1.0             120             110 1^0	110              100 170
		
		
TTAATGttTGGCTGTGACTAtTtAt1	111lAAGGATGGTATTGAGCCTATGTGGGAAGATGAGAAAAACAAACGGGGAGGACGATGGCTAATTACATl	~GAACAMtAGtAGAGAtGAAGTGAtt_C
AATTAC G GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTC CTAC CATAACTC G GATACAC CCTTCTACTCTTTTTGTTTG C C C CTC CTG CTAC C G ATTAATGTAJ		KTTGTTTGTC GTCTCTG CTTCACTGGAG
H                   H                   H                   i                   H H	* ACKGGATACACCCTTCTACTC	
		
L   M   P   G   <I   D   ¥   5 L	FKDG   I   E   P   M   W   E   DE   KNKRGGRW ITL	N   K   Q   Q   R   R   5   D L
UPPER - FORWARD - LEFT
5'
+ 5'-- 3'-
3' 5'
5'
LOWER - REVERSE - RIGHT
dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
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ODODODODODODO
5'CTTCTGCTCAATCTTTCTAC 3' forward
+ C' 1 ATGGÍTTCTG CTCAATCTTT CTACAáCCAA AGCTCTGTCT TGAAAATCAA
51 TGTCÁI     I I (j I (jCÁUjÁI (j Ál CäTGTTTT CCTTGATATC ATGTCACGCA
101 TGCTTCAACA CTCCAAATAC AGAGGTAATT AAATATTATT ATCATATTAT
151 ATATAATATG TTATTGATTT TTTGTTTGTG ATTTCATTTA GATTTTTATT
201 TCTATGATTT CTTAGCATGA AATACAATTT TTGGAGAAAC AACTAGCAGT
251 TTTAAAAACA AAACTTGAAT TTTGAGAAAT TCAAAGATGT TATATATATA
301 TGTCAAAATT TAACAATTAT TCTTCTAAAT CATCCGGATT CCGTTTACAT
351 GTACACATCT ACAATTTTCA ATTGAGGTAT TCTTGTTTTG ATGCCTTTGA
401 GACGAATAGT TTGATTGATA AAAAAAATTC TAACCAATAT GATATATAAA
451 GTTTATTTTC TTTTTGTCAA ACCATACTTT ATACTATGTA ACTTTTTTAA
501 GAGATTATTG AAAATAGTTT ATTTATAAAA TAGTAACCTA TTGTTGAATT
551 AAAAAAAAAA AAAAAATTdT A A ATT GTGTT TGCAAACGAC ATGTGATTTA
601 TCTTAGTTTA \AACTAGCTG ATATTCTTCA A flXGACTGT TCTTATAAGT
651 AATCAACCAArTÁGCÁTCAA TCÁCÁÁTÁÁÁ TTGTAAACAC TTCAATGAAA
701 ATGGTGATTT TAAAGAATAT GTTTTACTTA TGTTATGAAC TATCTCAAAT
751 TTGTGAAATA TTTCATAACT AATGTGGAAA ACTATATAAC CCCTCCATAC
801 AAAACGTAAG TAAAATTTAT GAAATCCTAT CATTTTTAAA GGTTAAACCA
851 ATCAAAAAGT AATAATTCTT GGTACTTGCA ATATTTTTGT CATTATATTT
901 TAGTTTATTA ATTTTATTTT GATTAAATGG TTTTAGATCC ATCAGTTATG
951 GAGATCGCAG TTATAGCTGT AGACGATCCG AAGAAAGCAT TATCTACTCT 1001 AAAAATTCAA CGAGACAATA TAGATCTCAT AATCACAGAT TATTATATGC 1051 CTGGTATGAA CGGTTTACAA CTCAAAAAAC AAATCACTCA GGAATTTGGA 1101 AATTTACCGG TCTTAGGTAA CATTTTTTGT TCTTTACAAC TTAAATTAAA
3'
n5:JJ3AAGAATATCAGCTAGTTT 3' reverse
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
DODODODODODOD
□ odododododod ododododododo
□ Odododododod ododododododo
	111 *y55y»h)l3(]3iWd3I3(])ldlSA035dHl
	
	
	
	^¥WMmí331¥3W53¥55335mD¥¥V¥¥W51¥3¥¥533151¥líí3¥51i¥1331¥53¥¥l 1111 W^lWlW31íHÍ5íHÍ5íH¥¥li
	
	
........i.........i....... CiE            ľJ9í' Cli	i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i c?£         oíe1        cil         c"í         ooe'        caz         osz'        cli cíjč
I7S   I :uu      OSE    I :sod
■ — ■ .......■ h ■ ■ ■. ..iH- ■ vlT      1 ■'■ . -- ■...      i. Z      m .1........        mm ■......jj. ■ ' ..			■1                      ■■ -1
			
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noai1      Don'      pmt1      prjsť      půtTi     rjúEť      qůíi1      quit1     qmi1       mé1       ohr1       ľkjí1       £*>?'       rjgs1 mi1			
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ododododododo
ododododododo
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ododododododo dodododododod ododododododo
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
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o □ o □ c
□ ono: o □ o □ c
□ ono:
OO
Search for Primers & Probes
Search Options Subsearches
Search in: ^ + Strand 5? - Strand Search Mode: ® Select Verify
■ Complex Substrate
© PCR Primers
Compatible with the Q Forward Primer C Reverse Primer O TaqMan Probes & PCR Pairs
Compatible with the C Upper Probe       O Lower Probe
O Molecular Beacons & PCR Pairs O Nested Primers
Sequencing Primers O Hybridization Probes
siRNA Probes
After successfull search show:   All Results
(   Search )
( Cancel ) (   Apply )
( Parameters ) ( Ranges ) ( Defaults )
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e ^ r"
Search for Primers & Probes
r
-[ Search Options    Subsearches ^
Search method: Compatible Pairs
0 Eliminate Ambiguous Bases 0 Duplex-free Oligonucleotides 0 Highly Specific Oligonucleotides (3'-end Stability) □ 5-end Stability _ siRNA Internal Stability 0 Oligonucleotides with CC Clamp 0 Oligonucleotides within Selected Tm Limits 0 Hairpin-free Oligonucleotides 0 Eliminate Mono- and Di-Nucleotide Repeats 0 Detect Sequence Repeats 0 Eliminate Frequent Oligonucleotides ^ Omit High Secondary Structure Regions in the Template @ Check Primers/Probe Sequence Constraints 0 Restrict the Number of C Bases 0 Eliminate False Priming Oligonucleotides and _ Continue Above Search in Other File(s) Consensus Primers
(   Search )
( Cancel ) (   Apply )
( Parameters ) ( Ranges ) ( Defaults )
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8 Q O_PCR
File: Human 4E.seq
	=É-	
-«r-		
Optimal Annealing Temperature: 50.S T (Max: 66.3 0Q
	Position and Length		T«TO	GCptí|	P.E#	Score
Product	862		7B.9	29.6	n/a	697
Forward Primer	9LS	22	56.9	45.5	47L/47L	840
Reverse Primer	L753	21	55.3	29.6	4S9 / 4S9	834
Upper Oligo	979	24	56.5	33.3	479 / 479	9L7
Lower Oligo	L694	23	55.4	39. L	457 / 457	64 L
Product Tm - Reverse Primer Tm: 23.6 rC
Primers Tm difference: L.6 "C Comments:
	Concentration	
Forward Primer	200.0	nM
Reverse Primer	200.0	nM
Upper Oligo	200.0	nW
Lower Oligo	200.0	nM
Monovalent Cation	50.0	rnM
Free Mg[2+|	0.7	m M
Total Na[+j Equivalent: L55.S mM
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
ODODODODODODO
Selected Primers
File: BRCA2 gene.seq
AY436640:1543SF22		AY436640:15917R20	
5' C AATATATA C C CTA CTCCCCTA 3'		5' CA C CTA C ATATTA C C C C A C A 3'	
Length:	22-rner	Length:	20-rner
Score:	B02 points	Score:	914 points
5' Position:	L543S	3' Position:	15917
Tm/tm: 53.4	52.6 rC	TmAm: 53.1	53.S rC
AG/Ag (25 ŮC): -30.5	-29.2 kcal/rnol	AC/Ag (25 ŮC): -2G.6	-2S.5 kcal/mo 1
A5/As:                     -472.1	-449.5 tal/ůK*mol	AS/As: -430.5	-419.6 cal/ĎK* mol
AH/Ah: -171.3	-163.2 kcal/rnol	AH/Ah: -L57.0	-153.6 kcal/mol
3'AC:	-6.5 kcal/rnol	3'AC:	-6.9 kcal/mol
Degeneracy:	___1	Degeneracy:	___1
P.E.#:	(443/443)	P.E.#:	(477/477)
1/E:	4^3 nmol/A2B0	1/E:	"   5^03 nmol/A2eo
31.1 ug/A2eů		31.0 Mg/A2C0	
Priming Efficiency PE Score
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
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ODODODODODODO
eoo
Current Oligo Duplexes
HAIRPIN intramolekulärni DIMER intermolekulärni
File: BRCA2 gene.seq
Current Oligo 2L-mer [5042)
[Currents Oligo] - The most stable 3-dimer: £ of hydrogen bonds = 10; AC = -0.7 kcal/mol
5 1 GAATTAGA TAAA TT'Z AAA T TA 3 1
III   II   II III 3r ATTAAAjCTTAflATAflATrAAG 5'
[Current- Oligo] - The most stable 3-dinier: * of hydrogen bonds = L0; AC = -7.3 kcal/mol; Tm = 2.9DC
5 h TAArnXjAATTTATCTAATTC 3 f
I I I I I I I I I I
3r CTTAATCTA T T T AA iZ TTTAAT 5'
The most stable dimer overall: # of hydrogen bonds = L0; AC = -7.4 kcal/mol; Tm = 2.2^
5r GAJOTAGATAAATTCAAATTA 3'
I I I I I I I I I I
3 1  ATTAAA:: TTAAATAGATTAA:^ 5 1
Hairpin: loop = S nt; AC = -3.0 kcal/mol; Tm = S4.6 "C
5 1 GAAT AG I I I I I A 3 1 ATTAAA:: TTAAAT1-
ODODODODODODO DODODODODODOD
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
DODODODODODOD ODODODODODODO
eoo
Current Oligo Hairpin Stems
File: BRCA2 gene.seq
Current Oligo ZL-tmer [5042j
L # of paired bases = 5; loop = 5 nt; AC = -3.0 kcal/rnol; Tm = 54.6 *C
5042				5046	5 'GAA1		ľAG-
	1 1 1				1 1 1		A
5056	CTTAA			5052	3 ' ATTAAACTTAAAT-1		
2. # oř paired bases = 6; loop = 5 nt; AG = 0.2 kcal/rnol; Tm = 2L7 °C
5043	AA1		ľAGA	5049	5	' GAA1		CAGATA-,	
	1 1		1 1			1 1		1 1 A	
5061	TTAAACT			5055	3	'ATTAAACTTA-1			
3. # of paired bases = 4; loop = 2 nt: AG = 0.9 kcal/rnol; Tm = 8.7 °C
5052 AATT 5055
I I
50G1 TTAA 5053
5 1 GAATTAGATAAATFCh
I I I I 3 1 AITAAAJ
3 UWA
DODODODODODOD
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO □ ODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
MASARYKOVA UNIVERZITA
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066   Reverse Primer False Priming Sites
Tile: M13MP18
Reverse Primer M13MP18:6310R19 (positive strand) Priming efficiency of the perfect match is 482 (above the threshold)
Priming efficiency. 482 (above the threshold)
5'(6328)   GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3'
Ml I I I I I I I I I I I I I I I I 3'(6328) ccaaaagggtcagtgctgc (6310)5*
Priming efficiency 244 (above the threshold)
5*(6328)   GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3'
I   I   I I I I IIIIII 3'(626) agcaaatggtc—tgctgc (610)5'
Priming efficiency: 193 (above the threshold)
5'(6328)   GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3'
I   II     MINIM III 3'(5125) tctaagtggtcagtg-tgc (5108)5'
□ ODO
u u u u o u
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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ODODODODODODO
© ^ CS     Forward Primer Composition
File: brca2 gene.seq
Forward Primer AY436640.6275F19
DODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
	64.2°	[nearest neighbor method]
Tm	56.5*	[nearest neighbor method]
Tm	70.8*	|XCC method]
Tm	56#	(2(A+TV + 4(G+C)# method]
Tm(RNAXlM Na]	81#	(XCC method]
Tm (DNA. RNA)[ 1M Na]	74.7*	[XCC method]
A260/A280	1.59	[single strand]
Molecular Weight	5.8K	[one strand]
Molecular Weight	11.7K	[two strands]
MQ/OD	47.4	(dsDNA)
Base    Number&X		
A	2	[10.5X]
C	S	[26.3%]
G	4	(21.IX)
T	8	(42.IX]
A + T	10	(52.6X]
G + C	9	(47.4X]
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
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ODODODODODODO
©oo
Oligonucleotide Database
File: NewDatabase.odb
9.
9L
# of Records: 29
Date
ID Number
Sequence
12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06 12/02/06
AY436 AY436 AY436 AY436 AY436 AY436 AY436 AY436
640:5916R19 640:5916R20 640:S937R21 640:5937R22 640:4695U22 640:5325U22 640:S7S6L23 640:5S60L19
AATCCCTCCCTTTAGTCTC CAATGCCTGCCTCTAGTCTG TC A ATTTCTTTA CCTTCCCAT
3'-Dim.AG
P.£ / p.e.
Tm ft
m
TTC A ATTTCTTTA CCTTCCCAT TCCCTTAA CAAAA CTAATCCAT AATTAC CTCTTTCTTATCCC AA CTCTCCCTACAACATTATCACTC AACAACCAAACCCAACCTC
0.3 n i
sc
s r
Selected oligo
0.3 0.3 -0.3 -0.9
5C SC
sc
5C
430 366 .449
ss
432 453 451
430
450 449 45S 432 453
451
54.1 54.5
50.9 57.2
54.7 53.1
55.9 53.S
54.5 53.0
53.3 54.S 55.3
53.0 55.0 55.9
Oligonucleotide Sets (64)
Forward Primer 1
B B
Reverse Primer
2
23
24
Upper Oligo i
Lower Oligo
25 25
2S 2S
Checked Set of nested primers
1	9	15	25	27
	9	16	25	27
	9	17	25	27
^^^^^^^^^^^	9	IS	25	27
This database is linked to BRCA2 gene.seq
T
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
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ODODODODODODO
eee
' File: HRCA2 gene.seq
Restriction Enzyme Sites in Protein
#	Enzyme	Site	#Cuts	Positions a Fragment 5izes												
																
4L	Kpnl	CT2VpzY6	S	-21253	23654	68	23722	52	23774	237	24011	585	24596	162	24758	Í
				629	253S7	1219	26606	22851								T r-
42	Mlul	TftlRVyA7	5	-22233	22674	2S24	2S49S	576	26074	106	26180	244	26424	23033		
43	Muni	QL3Nawl5	LO	-2L2S7	23620	355	23975	351	24326	2E2	24608	242	24850	72	24922	
				351	25273	714	25987	187	26174	420	26594	22863				
44	Nael	AG2PAxR6	7	-21823	230S4	597	23681	1286	24967	8.6	25053	573	25626	149	25775	
				623	2639S	23059										
45	Narl	GA2APzR6	L	■20043	24S64	24593										0
46	Ncol	PW3HGwM5	4	-22361	22546	336	22SS2	887	23769	531	24300	25157				
47	Ndel	HM2lawY5	2	-20366	24541	1211	25752	23705								
46	Nhil	A52l_Ax-6	16	-22276	22631	322	22953	185	23138	88	23226	27	23253	461	23714	í
				369	240S3	312	24395	288	24683	151	24834	273	25107	536	25643	
	^ ■ -- - - _		_1-Z3_	402	26045	30	26075	210 _l-iZi-	26285	372	26657 -■ -- ~f -	22800				
Search: 22454 to 27004 End Cut Type: Blunt. Odd, ^'-overhang. 5'-overhang
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
ododododododo dodododododod
ISIÍIÍIÍISIÍI     MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz
dodododododod ododododododo
d o o □
□ odododododod ododododododo
□ odododododod ododododododo dodododododod
o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□		
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o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o	□	o		
ODODODODODODO
60^
Concentrations
File: BRCA2 gene.seq
© Constant Concentration Constant Volume
© Current + Oligo: Q Current +Oligo: C Entire Sequence (da): O Forward Primer: C Reverse Primer: O F*CR Product (da]: 2 Upper Oligo: Q Lower Oligo:
5.0S nmol/ODř 32.5 ug/OD 4.G7 nmol/ODp 30.9 ug/OD 0.00L nmol/ODř 4S.L ug/OD 5.9E nmol/ODř 35.0 ug/OD 5.31 nmol/OD>34.0 ug/OD Q.L4G nmol/ODř 4S.L ug/OD 4.83 n mol/OD, 31.2 ug/OD 4.67 nmol/ODř 30.9 ug/OD
32.5 ug
or or in
yields
5.064
L.O OD(260) nmol
50S.4 uL
j
LO.O
uN'
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ODODODODODODO
AHP2 cDNA (TAIR database)!
Sequence: AT3G29350.1 Date last modified   2007-04-17 Name   AT3G29350.1 Tair Accession   Sequence:4010737427 Sequence Length (bp) 827
1 ACAATTCGCG AGAAAGACAA AACACAAGTT TCTTCTTCTT GGGATTGGCT 51 ATTTCCAGAA ATCCAAGTCA ATAATCAAAG TCCAAACAAA AAAATCCTCT 101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCATGGAC GCTCTCATTG CTCAGCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAA GAG A AAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAG 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTCCTCAA GTGGATATTA ACTAAAGAGA 601 CTAGTCCATA AGAAGAAAAA AG AT GATGAC TTTCTTTCTT TAGTTTCTCT 651 TCTAAATTAT TTTGGATTTG GTGTTTGCTC AAAAACTCAA TAAAATATGT 701 GCAAAAAGAA ACAAAAACAA GTGATGGTTG TTTATAAATC AGTAGTATGT 751 ATTGTTTGAT CTCATCCGAG AAAATTGAAA CCATTGGACT AATGAATGTG 801 ATGATAATAT ATATTGGTTT GCTTCTG
DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD
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ODODODODODODO
101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCATGGAC GCTCTCATTG CTCAGCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAG 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTCCTCAA GTGGATATTA AC T AAA GAG A
EcoRI restriction site
5 ......G| AATTC......3'
3"......CTTAA G......5'
Design of primers
AHP2ex_up
5'- CCG GAA TTC ATG GAC GCT CTC ATT GCT CAG - 3'
AHP2ex_low
5'- CCG GAA TTC TTA GTT A AT ATC C AC TTG AGG - 3'
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ODODODODODODO
101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCgŤGGÄČ GCTCTCATTG CTCÄČJCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAC 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTgČTČÄÄ GTGGATATTA ACŤÄ^AGAGA
EcoRI restriction site
5'. 3"
G AATTC......3'
CTTAA G......5'
Design of primers
AHP2ex_up
5'- CCG GAA TTC ATG GAC GCT CTC ATT GCT CA G - 3'
AHP2ex_low
5'- CCG GAA TTC TTA GTT A AT ATC C AC TTG AGG - 3'
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
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LITERATURA
I
Artificial DNA: Methods and Applications; Khudyakov, Y.E., Fields, W.A., Ed. (2003)
PCR Primer: A Laboratory Manual (2003)
OLIGO Primer analysis software, Version 7
Expert Opin Ther Pat. 2014, 24(7):801-19.
Oligonucleotide delivery: a patent review (2010 - 2013).
AAPS Journal 2009, 11(1): 195-203.
Targeted Delivery Systems for Oligonucleotide Therapeutics
Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications
Nature Methods 2014, 11 (5): 499
ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO
ODODODODODODO
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Discovery is not in seeking new landscapes, but in having new eyes...
Marcel Proust
Tato prezentace vznikla s podporou projektu op VK „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiký'(CZ. 1.07/2.3.00/09.0132)
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
EVROPSKÁ UNIE
MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY
OP Vzdělávání pro konkurenceschopnost
m
INVESTICE  DO  ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ