1/1 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 1/2 Proč biofyzikální metody? * Biofyzikální metody využívají fyzikální principy ke studiu biologických systémů * Poskytují kvantitativní údaje, což usnadňuje srovnávání různých experimentálních systémů Proč fluorescence? * Umožňuje nám vidět pouhým okem, co bychom jinak neviděli 1/3 Obsah přednášek * Absorbční a flouorescenční spektroskopie v biologické analýze molekul * Vlastní fluorescence proteinů * Časově ustálená a časově rozlišená fluorescence (Steady state, Time-resolved) * Zhášení fluorescence, fluorescenční rezonanční přenos energie - použití při sledování strukturních změn molekul * Anizotropie fluorescence a její změna při interakci makromolekul * Nevlastní fluorescence - fluorescenční značky, sondy a indikátory * Fluorescenční značení DNA a proteinů * Fluorescenční mikroskopie * Analytické použití fluorescence pro stanovení koncentrace molekul * Příklady využití fluorescence v biologické praxi 1/4 1/5 Praktické úlohy * Měření spektrálních charakteristik proteinů a nukleových kyselin * Stanovení koncentrace nukleových kyselin a proteinů za použití fluorescence a absorbční spektroskopie (kolorimetrie) * Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluorescenčních sond * Měření vlastní fluorescence proteinů * Příprava fluorescenčně značeného proteinu nebo DNA * Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci * Využití fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET) při sledování hybridizace komplementárních řetězců nukleových kyselin * Sledování změny intenzity fluorescence po relaxaci vlásenkové struktury fluorescenčně značené DNA * Real-time PCR - detekce amplifikace DNA * Fluorescenční mikroskopie (fluorescenční in situ hybridizace) * Studium interakce molekul za pomocí anizotropie fluorescence vazba proteinu a fluorescenčně značené DNA 1/6 1/7 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Schematické znázornění metodických přístupů použitých při praktické výuce předmětu Příprava fluorescenčně značené DNA Při přípravě fluorescenčně značené DNA se používá gelová filtrace pro separaci nenavázaného fluoroforu po značení fragmentu DNA Studium vazby DNA a proteinu Anizotropie fluorescence EmiseEmiseEmise detektor + - = 2II II r polarizátor analyzátor Snížení pohyblivosti po vazbě proteinu => pomalejší změna uspořádání molekul => zvýšení anizotropie fluorescence r Excitace t~ns 0 5 10 15 0,20 0,25 0,30 F.Anisotropie Protein c (M) Vazebná konstanta K -> G nízká anizotropie vysoká anizotropie Experimentální uspořádání při měření anizotropie fluorescence r Záznam změny anizotropie fluorescence r po vzájemné vazbě proteinu a DNA Fluorescenční mikroskopie sledování hybridizace in situ Metafazové chromozómy po fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) Fluorescenční emisní (A) a UV/Vis absorbční spektrum (B) fluorescenčně značené DNA Spektroskopická charakterizace fluorescenčně značené DNA 200 300 400 500 600 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 ABS (nm) 500 550 600 650 0 10 20 30 40 IntenzitaFluorescence (nm) A B Real-time PCR detekce amplifikace DNA Emitor Zhášedlo F primer R primer Intenzita emitovaného záření je přímo úměrná množství amplifikované DNA. Vizualizace molekul při elektroforetické separaci 1/8 Příprava fluorescenčně značené DNA Při přípravě fluorescenčně značené DNA se používá gelová filtrace pro separaci nenavázaného fluoroforu po značení fragmentu DNA Výhody fluorescenčního značení molekul * není nutno pracovat s radioaktivitou * dlouhá životnost značení * možnost kvantitativního vyhodnocení množství DNA * vysoká citlivost 1/9 UV/Vis absorbční spektrum (-) Spektroskopická charakterizace fluorescenčně značené DNA 200 300 400 500 600 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 ABS (nm) 500 550 600 650 0 10 20 30 40 IntenzitaFluorescence (nm) fluorescenční emisní spektrum (-) 1/10 Vizualizace molekul při elektroforetické separaci Změna rychlosti putování v PA gelu po vazbě proteinu na DNA Jenom DNA protein + DNA protein fluorescenceCoomasiepřekryv 1/11 Real-time PCR detekce amplifikace DNA Zhášedlo Emitor F primer R primer 1.Značená sonda se hybridizuje s komplementární sekvencí. Záření Emitoru je zhášeno a není pozorováno. 2.Při polymerizaci dochází k nahrazení sondy novým řetězcem. 3.Při každém amplifikačním cyklu odštěpuje polymeráza Emitor, jehož záření je detekováno 4.Polymerizace je dokončena. Intenzita emitovaného záření je přímo úměrná množství amplifikované DNA. 1/12 Fluorescenční mikroskopie sledování hybridizace in situ Metafázové chromozómy po fluorescenční in situ hybridizaci (FISH) 1/13 Fluorescenční anizotropie polarizátor analyzátor detektor + - = 2II II r 1/14 Princip sledování vazby makromolekul Excitace nízká anizotropie vysoká anizotropie t ~ ns Emise 1/15 Vazba proteinu na DNA 0,17 0,22 0,27 0,32 0 5 10 15 protein (M) Anizotropie K = 2 . 10-6 M 1/16 Kde se dají využít získané znalosti? * Tam, kde se setkáte v praxi s fluorescencí a fluorescenční spektroskopií * Když máte vzorku málo pro klasické metody detekce, zviditelníte si ho pomocí fluorescence * V každodenní laboratorní praxi * V navazujících cvičeních Bi7230c ! Multicolor Detection: Image Stain Target Color DAPI Nucleii Blue BO DIPY FL phallacidin F-actin Green MitoTracker Red CMXRos Mitochondria O range 1/18 Průtoková cytometrie - Flow Cytometry Detekce každé buňky zvlášť Rozdělení populace buněk podle jejich velikosti a přítomnosti fluorescenčních sond 1/19 Biofyzikální přístupy kolem nás 1/20 Fluorescence, kde bychom ji nečekali 1/21 Příště: Co všechno svítí na diskotéce?