Barevné principy absorpce a fluorescence Ctirad Hofr Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii 2 2 Světlo je elektromagnetické vlnění • Skládá se z elektrické složky a magnetické složky, které kmitají ve fázi v na sebe kolmých rovinách • Světlo je charakterizováno frekvencí f a vlnovou délkou l • Frekvence f udává kolikrát za sekundu vlnění kmitne, udává se v Hz = s-1 • Vlnová délka udává délku, kterou za jeden kmit světlo urazí, udává se v nanometrech nm = 10-9 m • Frekvence f a vlnová délka l jsou spojeny vztahem c = l f kde c je rychlost světla -vlnění (c=299 792 458 m s-1 ve vakuu) • Energie E = h f, kde h je Planckova konstanta (6.626 10-34 J s) 2 3 l Animace elektromagnetického vlnění http://www.edumedia-sciences.com/a185_l2-transverse-electromagnetic-wave.html Elektromagnetická vlna z xy c = l f c je konstanta, pak jestliže se zvýší vlnová délka, musí se snížit frekvence, aby byl součin konstantní. Vlnová délka l je nepřímo úměrná frekvenci f E = h f Čím je větší frekvence, tím je větší energie záření. Čím je vetší vlnová délka l, tím je menší energie záření. B E Viditelné spektrum Z celého spektra záření je pouze malá část viditelná. Viditelné spektrum je ohraničeno vlnovými délkami 400 nm a 700 nm. http://science.hq.nasa.gov/kids/imagers/ems/visible.html 400 nm 7.5 1014 Hz 700 nm 4.3 1014 Hz 2 5 Intenzita Intenzita – počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času 2 6 Absorpce • Látka pohlcuje světlo • Pro absorpci monochromatického světla • Lambert-Beerův zákon: Absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce vrstvy roztoku lc II    100 I I lcA 0 10log  =molární extinční koeficient látky, c-koncentrace, l-délka optické dráhy 2 7 Závislost absorbance na poměrné intenzitě dopad. a prošlého světla 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 I0/I Abs 2 8 Luminiscence • Emise světla z nějaké látky; nastává z elektronových excitovaných stavů Luminiscence se dělí na: 1.fluorescenci 2.fosforescenci Podle původu dělíme luminiscenci na 1.fotoluminiscenci 2. chemiluminiscenci 2 9 Fluorescence • Emise z excitovaných singletových stavů • Prakticky: fluorescenci pozorujeme během buzení a po jeho vypnutí rychle mizí • Doba dohasínání t (Lifetime) je průměrný čas, který uplyne od excitace po emisi – je řádově 1 – 10 nanosekund • pozn. : světlo urazí za 1 ns 30 cm 2 10 Fosforescence • Emise z excitovaných (zakázaných) tripletových stavů • Prakticky: fosforescence má mnohem delší dobu dohasínání než fluorescence Doba dohasínání řádově milisekundy až sekundy pozn. : světlo urazí za tu dobu 300 až 300 000 km 2 11 Frank-Condonův princip o „lenosti jader“ při absorpci Absorpce fotonu elektronem (excitace molekuly) je velmi rychlý proces v řádu femtosekund (10-15s). Protože atomové jádro je mnohem těžší než elektron, během absorpce fotonu se nepohybuje. Po absorpci fotonu - excitaci se celá molekula nachází v nestabilním stavu („je horká“) a vibruje, aby se zbavila energie (a „ochladila se“). 2 12 Absorpce a emise energie molekulou Energie 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost Základní stav Excitovaný stav 2 13 Zářivé a nezářivé přechody mezi elektronově vibračními stavy molekuly absorpce fluorescence fosforescence l t  10-15 s t  10-8 s t  10-3-100 s absorpce fluorescence fosforescence T1 S2 vnitřní konverze mezisystémová konverze S1 vibrační relaxace EnergieE=hf 2 14 Barevný animovaný úvod do principu fluorescence http://probes.invitrogen.com/resources/educ ation/tutorials/1Intro/player.html 2 15 Stokesův zákon Vlnová délka emitovaného světla je větší nebo rovna vlnové délce excitačního světla lem ≥ lex To je dáno tím, že po absorpci záření často dochází k částečné ztrátě energie (tepla) při přechodu z vyšších excitovaných elektronových stavů do metastabilního nejnižšího excitovaného stavu. lEx 520 nm lEm 560 nm 2 16 Stokesův posun Emise má vždy menší energii (větší vlnovou délku) než je energie absorbovaná (menší l). Rozdíl mezi maximem absorpčního a maximem fluorescenčního emisního spektra je specifická charakteristika daného fluoroforu. 2 17 Experiment G. G. Stokese Slunce Modré sklo okna v kostele Propouští světlo s l < 400 nm Excitační filtr Roztok chininu Sklenice vína Propouští světlo s l > 400 nm Emisní filtr G.G. Stokes 1852, Cambridge 2 18 Po záměně filtrů – fluorescence mizí Při záměně filtrů , tj. jestliže dáme sklenici vína do dráhy slunečních paprsků, procházející světlo již nemůže roztok chininu excitovat. 2 19 Typické fluorofory Fluorofory nebo fluoreoscenční barviva jsou molekuly, které fluoreskují. Fluorescenci vykazují zejména aromatické sloučeniny (polyaromatické uhlovodíky nebo heterocykly). Typickými flourofory jsou například: •chinin (tonik) •fluorescein, rhodamin B (nemrznoucí směsi, fluorescenční značení) •POPOP (scintilátory) •Acridinová oranž, ethidium bromid (DNA) •umbeliferon (ELISA) •antracén, perylén (znečištění životního prostředí oleji) 2 20 Využití fluorescence v geografii 2 21J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 2 22 Kvantový výtěžek Kvantový výtěžek Q je poměr počtu emitovaných a absorbovaných fotonů. Udává účinnost s jakou budící fotony vyvolávají fluorescenci. Kvantový výtěžek může být maximálně 1. Ve skutečnosti je nižší díky nezářivým přechodům molekul z excitovaného stavu. Největší kvantové výtěžky mají rhodaminové flourofory (~1) a fluorescein (0.95) http://www.iss.com/resources/reference/data_tables/FL_QuantumYieldStandards.html Charakteristické je snižování kvantového výtěžku s teplotouteplotní zhášení luminiscence 2 23 Excitační spektrum Závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce při konstantní vlnové délce emitovaného záření lEm= konst.lEx scan 2 24 Emisní spektrum Závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní excitační vlnové délce lEx= konst. lEm scan 2 25 Neměnnost tvaru emisního spektra Tvar emisního spektra je nezávislý na vlnové délce excitace. Tento jev je důsledkem toho, že doba trvání excitovaného stavu a kvantový výtěžek složitých molekul v roztoku nezávisí na vlnové délce budícího záření 2 26 Barevný animovaný úvod do fluorescenční spektroskopie http://probes.invitrogen.com/resources/educ ation/tutorials/2Spectra/player.html 2 27 Zrcadlová symetrie absorpčního a excitačního spektra Energie 0 2 0 2 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost Abs Emis. 0 2 0 10 1 0 2 0 0 Vlnová délka l Základ. stav Excit. stav 2 28 Zákon zrcadlové symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem Struktura vibračních hladin u základního a excitovaného stavu je stejná, proto absorpce a emise z odpovídajících si vibračních hladin může nastat se stejnou pravděpodobností. To má za následek zrcadlovou symetrii absorpčního spektra a emisního fluorescenčního spektra. Prakticky: při velmi malé koncentraci vzorku můžeme z flourescenčního emisniho spektra zjistit jak vypadá absorpční spektrum, aniž by se použilo o několik řádů větší množství vzorku 250 300 350 400 450 500 550 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Excitation EmissionFluorescenceIntensity l Quinine Solution 2 29 Flourescenční excitační a emisní spektrum reálného roztoku Při měření reálných vzorků se zrcadlová symetrie narušuje vlivem ionizace fluoforu při různém pH, komplexace fluoroforu s dalšími molekulami v roztoku, nebo jednoduchým příspěvkem dalších nefluorescenčních molekul k absborbčnímu (excitačnímu) spektru. 2 30 Příště: • Co je potřeba, abychom mohli změřit spektrum fluoroforu? • Jak můžeme detekovat fluorescenční molekuly v gelu?