4 1 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr Ustálená fluorescence (Steady State Fluorescence) 4 2 Ustálená a časově rozlišená fluorescence * Ustálená fluorescence (Steady State) se měří při buzení kontinuálním zářením a dostáváme potom časovou střední hodnotu intenzity či polarizace fluorescence. * Časově rozlišená fluorescence se měří pomocí pulzní excitace (délka pulzu je obvykle kratší než doba dohasínání fluorescence vzorku) nebo fázově modulovaného budícího záření a umožňuje analyzovat časové závislosti měřených parametrů, především anizotropie fluorescence. 4 3 Vliv prostředí na absorpční a emisní spektra V roztocích dochází vlivem elektrostatických interakcí dipól-dipól, nebo dipól-indukovaný dipól mezi molekulami fluoroforu a rozpouštědla k solvataci fluoreskujících molekul. Protože molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti, dochází při měření fluorescence v roztocích ke změnám v optických spektrech vlivem různé solvatace molekul. Doba potřebná pro molekulární relaxace (10-10s) je mnohem delší, než je rychlost elektronového přechodu - absorpce (10-15s) , ale obvykle kratší, než doba života excitovaného stavu (10-8s) . K emisi proto dochází ze stavu, kdy již bylo dosaženo rovnovážné konfigurace. Protože část absorbované energie se spotřebuje na relaxaci molekul rozpouštědla kolem molekuly fluoroforu v excitovaném i základním stavu, je energie emitovaného fluorescenčního záření menší, než by odpovídalo čistě elektronovému přechodu. Z. Fišar: http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm 4 4 Elektrický dipól * Je tvořen dvojicí nábojů o opačné polaritě ve vzdálenosti l * Dipólový moment = q . l vektor směřující od záporného náboje ke kladnému náboji Jednotkou je Debye; 1D = 3.3 x 10-30 C.m q+ q- l 4 5 Molekulové dipóly * Molekula je dipólem, když se rozložení kladného a záporného náboje nepřekrývá. V případě, kdy není molekula zrcadlově symetrická je rozložení náboje nepravidelné a molekula je dipólem. * Molekula, která má dipolový moment je polarizovaná. * Molekuly (zpravidla zrcadlově symetrické CO2), které nejsou dipóly se jimi mohou stát, když se molekula nachází v elektrickém poli vzniká indukovaný dipól. 4 6 Dipólový moment polyatomických molekul Physical Chemistry Atkins and de Paula, Chapter 17 4 7 Interakce dipólů * Polarizované molekuly upřednostňují uspořádání s minimální energii dipólů 4 8 Polarizovatelnost molekul * Schopnost molekul vytvořit indukovaný dipól vlivem elektrického pole * Velikost indukovaného dipólu je přímo úměrná intenzitě elektrického pole E * Indukovaný dipól * = E je polarizovatelnost molekul Čím větší je polarizovatelnost molekuly, tím větší vliv elektrického pole na molekulu. 4 9 Změna dipólu při interakci molekul http://www.theochem.ruhr-uni-bochum.de/~axel.kohlmeyer/cpmd-vmd/part3.html 4 10 Interakční energie dvou dipólů * Interakce mezi dvěma dipóly 1 a 2 3 0 2 21 4 )cos31( r V - -= q2 q1 rl1 Pro dipól-dipólovou interakci je potenciální energie V závislá na vzájemné orientaci. Minimální energie je při = 0° přitažlivé interakce (opačné náboje jsou u sebe) < 54.7 ° Maximální energie je při = 180° odpudivé interakce (stejné náboje jsou u sebe) > 54.7 ° Nulová potenciální energie je při ,,magickém" úhlu = 54.7° l2 -q2 -q1 4 11 Interakce dipól-indukovaný dipól * Polární molekula s dipólovým momentem 1 může indukovat dipólový moment v polarizovatelné molekule * Indukovaný dipól interaguje s permanentním dipólem první molekuly a dochází k vzájemnému přitahování * Indukovaný dipól (modré šipky) následuje změny v orientaci permanentního dipólu (žluté šipky) 6 0 2 2 1 r V -= 4 12 Solvatace fluoroforu při absorpci a emisi v roztocích. V roztocích dochází vlivem elektrostatických interakcí dipól-dipól, nebo dipól-indukovaný dipól mezi molekulami fluoroforu a rozpouštědla k solvataci fluoreskujících molekul. Protože molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti, dochází při měření fluorescence v roztocích ke změnám v optických spektrech vlivem různé solvatace molekul. Doba potřebná pro molekulární relaxace (10-10s) je mnohem delší, než je rychlost elektronového přechodu - absorpce (10-15s) , ale obvykle kratší, než doba života excitovaného stavu (10-8s) . K emisi proto dochází ze stavu, kdy již bylo dosaženo rovnovážné konfigurace. Protože část absorbované energie se spotřebuje na relaxaci molekul rozpouštědla kolem molekuly fluoroforu v excitovaném i základním stavu, je energie emitovaného fluorescenčního záření menší, než by odpovídalo čistě elektronovému přechodu. 4 13 Faktory ovlivňující emisní spektrum a kvantový výtěžek * Polarita a viskozita prostředí (rozpouštědla) * Rychlost relaxace molekul rozpouštědla * Konformační změny flourescenční sondy * Neměnnost lokálního prostředí molekuly * Vnitřní přenos náboje (uvnitř molekuly) * Protonový přenos a reakce excitovaných stavů * Interakce sonda ­ sonda * Změny v rychlostech zářivých a nezářivých procesů 4 14 Vliv polarity rozpouštědla * Dipólový moment molekuly v excitovaném stavu E je větší než v základním stavu G * Po excitaci se molekuly rozpouštědla orientují (relaxují) okolo E, což snižuje energii excitovaného stavu Čím větší je polarita rozpouštědla, tím větší je vliv orientace dipólů a tím větší energie se spotřebuje na jejich orientaci a zbude pak menší energie na emitované světlo, tj. tím vetší je jeho vlnová délka. 4 15 Interakce excitovaného fluoroforu a rozpouštědla Čím větší je polarita rozpouštědla, tím větší je vliv orientace dipólů, tím menší je energie emitovaného záření a tím větší je posun emitovaného světla. Nejcitlivější na polaritu rozpouštědla jsou fluorofory, které jsou samy polární. Nepolární fluorofory jsou méně citlivé. 4 16 Závislost dipólového momentu na tvaru molekul Změna dipólového momentu je větší u delších fluoroforů Aminonaftalenové deriváty s fenylovou skupinou vykazují větší citlivost na rozpouštědlo a větší dipólové momenty v excitovaném stavu pravděpodobně díky větší separaci náboje podél delšího aromatického systému. Změna dipólového momentu po excitaci je větší u delších molekul. 4 17 Rozdíl vlivu polarity rozpouštědla na absorpční a emisní spektrum Se zvyšující se polaritou rozpouštědla se mění fluorescenční spektrum mnohem více než absorpční spektrum. ABS Zvyšování molární koncentrace metanolu v hexanu v rozsahu 0-340 mM (0 -> 6) Absorpční spektrum 2-acetylantracenu v čistém hexanu (0), 200mM roztoku metanolu v hexanu (1) a čistém metanolu (2). 2-acetylantracen 4 18 Sondy na sledování polarity okolí * Přidání polárních skupin k fluoroforu zvyšuje jeho citlivost na polaritu rozpouštědla * Přidání polárnějších skupin také zvyšuje Stokesův posun Deriváty DOP (2,5-difenyloxazolu) a jejich emisní spektra 4 19 Proč je emisníní spektrum citlivější na polaritu prostředí než absorpční spektrum? * Protože absorpce je rychlejší než emise a ta je zase pomalejší než relaxace molekul * Časová posloupnost: Absorpce (10-15s) -> relaxace okolí (10-10s) ->emise (10-8s) * Absorbce nemůže zachytit změny v lokálním prostředí molekuly, protože proběhne rychleji než k nim dojde. * Před absorpci a po ní je okolí molekuly stejné. * Naproti tomu při emisi už je molekula fluoroforu obklopena relaxovaným (změněným) prostředím. 4 20 Závislost emisního spektra na polaritě rozpouštědla Podle zvyšující se polarity: H ­ hexan CH- cyklohexan T- toluen EA ­ etylacetát Bu ­ n-butanol polarita 4 21 Praktická ukázka * Prodan (N,N-Dimethyl-6-propionyl-2-naphthylamine) O CH3 N CH3 CH3 C - Cyklohexanol G ­ Glycerol D - dimetylformamid E - Etanol CH3CH2OH V - Voda Bu - n- Butanol CH3CH2CH2CH2OH OH OH OH OH N CH3 CH3 O H polarita 4 22 Změna emisního spektra po vazbě molekul ANS na HSA Prodan na protein DAPI na DNA EtBr na DNA Citlivosti fluorescenčních sond na okolní prostředí se využívá při sledování vazby a kvantifikaci množství biologických molekul. Kvantový výtěžek se často zvyšuje při vazbě fluoroforů na proteiny nebo DNA. Toho se využívá při sledování vazby. 4 23 Zvýšení intenzity fluorescence ANS po vazbě na lidský sérový albumin ANS (1-anilinonaftalén-8-sulfonát sodný): * MW = 321,33 * rozpouštědlo pro zásobní roztok: dimetylformamid (DMF) * rozpouštědlo pro spektroskopická měření: metanol (MeOH) * dlouhovlnné absorpční maximum v metanolu: exmax = 372 nm (molární extinkční koeficient: 7800 cm-1M-1) * fluorescenční emisní maximum v metanolu: emmax = 480 nm * kvantový výtěžek fluorescence je závislý na okolním prostředí a je zvláště citlivý na přítomnost vody; emise je závislá na rozpouštědle * podrobný popis vlastností ANS lze nalézt v práci [Slavík J.: Anilinonaphthalene sulfonate as a probe of membrane composition and function. Biochim. Biophys. Acta 694, 1-25 (1982)] 4 24 Co se stane, když se naváže PRODAN na BSA? Posune se maximum vlnové délky z 520 nm na 460 a přesto, že se zvýší intenzita emise, nepozorujeme ji, protože oko má nižší citlivost na světlo s =460 nm. Postupnou vazbu PRODANu na BSA lze lépe sledovat jako úbytek emise volného fluoroforu 460 nm 520 nm Samotný PRODAN PRODAN + BSA Citlivost oka 4 25 Vazba DAPI na DNA * DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole ) * Ex. 355 nm / Em. 461 nm * Vazba do malého žlábku * Největší nárust intenzity při vazbě v blízkosti AT bohatých oblastí 4 26 Vazba EtBr na DNA Vlastnosti sondy ethidium bromidu: * MW = 394,31 * dobře rozpustný ve vodě * ve vodě fluoreskuje málo, po navázání k DNA se fluorescence zvyšuje asi 30 krát * doba dohasínání fluorescence ve vodě je asi 1,7 ns, po vazbě k dvouřetězcové DNA se zvyšuje na 20 ns * vazba k DNA se uskutečňuje interkalací (vmezeřováním) rovinného aromatického kruhu mezi páry bazí dvouřetězcové DNA * absorpční maximum v DNA: exmax = 523 nm * fluorescenční emisní maximum v DNA: emmax = 604 nm 4 27 Další mechanismy spektrálního posunu * Vodíkové můstky v rozpouštědle * Vnitřní přenos náboje (uvnitř molekuly) * Rychlost relaxace molekul rozpouštědla * Interakce sonda ­ sonda * Konformační změny flourescenční sondy * Změny v rychlostech zářivých a nezářivých procesů Čárkované šipky znamenají, že přechody mohou být zářivé nebo nezářivé 4 28 Vliv teploty na emisní spektrum * Snížení teploty zpravidla způsobuje zvyšování viskozity rozpouštědla a tím se zvyšuje také čas potřebný k orientaci molekul rozpouštědla * Čím nižší je teplota, tím méně molekul se vrací do základního stavu s relaxovanými okolními molekulami rozpouštědla ­ tím méně se energie spotřebovává a tím je posun menší 4 29 Závislost emisního spektra na teplotě Snížení teploty prodlužuje čas potřebný k relaxaci rozpouštědla. Snížení teploty má podobný vliv jako snížení polarity rozpouštědla 4 30 Interakce sonda-sonda excimerová fluorescence Molekuly fluoroforu mohou se sebou vzájemně vytvářet excitovaný komplex excimer. Excimer je zkráceně excitovaný dimer. V případě dvou různých molekul se jedná o exiplex. Pro vytvoření excimeru je nutné, aby byly molekuly v kontaktu. Emisní pás excimerové fluorescence je posunut k větším vlnovým délkám ve srovnání s fluorescencí izolovaných molekul. 4 31 Použití excimerů při detekci inserčních mutací DNA ˇOligonukleotid s připojenými pyrenovými zbytky na místě jedné báze ˇKdyž se váže na WT nemutovanou DNA, jeden pyrenový zbytek se interkaluje, druhý je vně dvoušroubovice ˇKdyž se váže na DNA s mutací, která obsahuje jednu bázi navíc, dojde k vytvoření excimeru. Ěxcimerová emise ukazuje, že se jedná o inserčního mutanta 4 32 Zhášení fluorescence * Zhášení fluorescence lze definovat jako bimolekulární proces, který snižuje kvantový výtěžek fluorescence (tzn. intenzitu fluorescence) beze změny fluorescenčního emisního spektra. Může být důsledkem různých procesů. * Srážkové (dynamické) zhášení nastává, když je fluorofor v excitovaném stavu deaktivován (tj. navrací se nezářivě do základního stavu) při srážce s molekulou zhášedla. Molekuly nejsou při tomto procesu chemicky změněny na rozdíl od * statického zhášení, kdy se po kontaktu fluoroforu a zhášedla vytváří nefluorescenční komplex. * Samozhášení je zhášení fluoroforu jím samotným; nastává při jeho vysokých koncentracích nebo při vysoké denzitě značení. 4 33 Dynamické zhášení Snížení intenzity fluorescence dynamickým zhášením je popsáno Sternovou-Volmerovou rovnicí: F0/F = 0/ = 1 + kq 0 Cq kde je F0 ­ kvantový výtěžek fluorescence za nepřítomnosti zhášedla, F - totéž za přítomnosti zhášedla o koncentraci Cq, 0 ­ doba dohasínání fluorescence bez zhášedla, - doba dohasínání v přítomnosti zhášedla, kq ­ bimolekulární zhášecí konstanta (= bimolekulární rychlostní konstanta určená difúzí vynásobená účinností zhášení). Hodnota kq udává koncentraci zhášedla, při které se sníží intenzita fluorescence na polovinu. Nejčastějším zhášedlem fluorescence i fosforescence je molekulární kyslík (O2). Dále fluorescenci zhášejí (v důsledku mezisystémové konverze) atomy halogenů jako je bróm a jód. Často používaným zhášedlem je také akrylamid. 4 34 Statické zhášení * Vytváří se komplex fluoroforu a zhášedla, který již nefluoreskuje * Platí pro něj také Sternova-Volmerova rovnice: F0/F = 0/ = 1 + Ka 0 Cq Kde Ka je asociační konstanta fluoroforu a zhášedla Typickými statickými zhášedly jsou: Báze nukleových kyselin Nikotinamid Těžké kovy Guanin 4 35 Rozdílná závislost dynamického a statického zhášení * Oba druhy zhášení ukazují stejnou závislost na koncentraci zhášedla. * Při statickém zhášení se pouze ,,zneviditelní" část fluoroforů, které vytvoří komplexy. Nemění se doba dohasínání fluorescence . * Při dynamickém zhášení se doba dohasínání mění Statické zhášeníDynamické zhášení 4 36 Závislost obou druhů zhášení na teplotě * Dynamické zhášení se s rostoucí teplotou zvyšuje. Zvyšuje se pohyblivost molekul zhášedla, které takto za stejný čas ,,uhasí" více molekul fluoroforu. * Statické zhášení se s rostoucí teplotou snižuje, protože dochází snadněji k disociaci slabě vázaných komplexů flouroforu a zhášedla. Statické zhášeníDynamické zhášení 4 37 Využití zhášení při lokalizaci fluoroforu V membráně * Jestliže je fluorofor P1 zanořen v membráně, je pro zhášedlo Q nedostupný a ke zhášení téměř nedochází. * S rostoucí koncentrací zhášedla se intenzita fluorescence téměř nemění. Na povrchu * Jesltiže je fluorofor P2 na povrchu, dochází k účinnému zhášení. * S rostoucí koncentrací zhášedla intenzita fluorescence velmi výrazně klesá. Zanořen v membráně Vystaven na povrchu 4 38 Literatura * Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. * Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R.Lakowitzem. Poděkování