6 1 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr Anizotropie fluorescence 6 2 Jev anizotropie * Jestliže dochází k excitaci světlem kmitajícím v jedné rovině, emise fluorescence se často stává polarizovanou. * Úroveň polarizace emise je popsána veličinou anizotropie (nestejnorodostí). Látky, které vykazují určitý stupeň nestejnorodosti, emitují polarizovanou fluorescenci. * Co způsobuje, že je emitované světlo polarizované? 6 3 Dipólové momenty přechodu * Dipólový moment přechodu je kvantově mechanická záležitost. Není skutečným dipólovým momentem. Je dán okamžitým stavem elektronového obalu molekuly. Velikost dipólového momentu přechodu udává schopnost daného stavu molekuly absorbovat nebo emitovat světlo. Směr dipólového momentu přechodu udává směr, ve kterém je světlo molekulou nejlépe absorbováno nebo emitováno. * Molekuly přednostně absorbují záření, jehož elektrická složka kmitá ve stejné rovině jako je absorpční dipólový moment přechodu elektronu do výšší energetické hladiny. * Molekuly přednostně emitují záření ve stejné rovině jako je emisní dipólový moment přechodu elektronu do nižší energetické hladiny. Absorpce Emise 6 4 Fotoselekce * Je-li roztok fluoroforů excitován lineárně polarizovaným zářením, potom budou excitovány pouze ty molekuly, které mají nenulový průmět svého absorpčního přechodového momentu do směru polarizace budícího záření 6 5 Anizotropie fluorescence polarizátor analyzátor detektor + - = 2II II r 6 6 Intenzita fluorescence Z teorie depolarizace fluorescence vyplývá, že intenzita fluorescence pozorovaná pomocí analyzátoru, který je otočen o úhel od směru rovnoběžné polarizace je I(t) = cos2 III (t) + sin2 Iv(t) polarizátor analyzátor 6 7 Při jakém úhlu natočení polarizátorů můžeme změřit celkovou intenzitu fluorescence? * Celková intenzita fluorescence += 2III celk += III 22 cossin 1cossin 22 =+ 3 1 cos = = 54,7 ° 6 8 Celková intenzita se měří při magickém úhlu * Celková intenzita I(t) = III (t) + 2 Iv(t) nezávisí na rotačním pohybu fluoroforu a měří se pod ,,magickým" úhlem 54,7° 6 9 Časová závislost polarizované fluorescence a pro časovou závislost anizotropie platí r(t) = (3 cos2 (t) 1)/5 kde je - úhel dipólové reorientace v čase od 0 do t - úhel mezi dipólovým momentem absorbce a emise Absorpce Emise Dipólové momenty 6 10 Maximální hodnota anizotropie * Ze vztahu plyne, že za nepřítomnosti depolarizace (např. ve zředěných zmrzlých roztocích za nepřítomnosti depolarizačních mechanismů a za předpokladu, že jsou přechodové momenty absorpce a emise rovnoběžné) je mezní hodnota anizotropie fluorescence buzené polarizovaným zářením dána pouze fotoselekcí. 5 )1cos3( 2 0 - = r r0 max = 2/5 = 0.4 6 11 L a T uspořádání měření 6 126 12 Měření anizotropie při ustálené fluorescenci * Anizotropie - měří polarizovanou emisi * Polarizátor je na dráze excitačního světla a dělá z něj rovinně polarizované * Polarizátor (analyzátor) je na dráze emitovaného světla fluorescence * Měří se intenzita fluorescence při natočení polarizátoru vertikálně a analyzátoru vertikálně (VV), následně při natočení polarizátoru vertikálně a analyzátoru horizontálně(VH) * Ze změřených intenzit se vypočítá hodnota anizotropie VHVV VHVV II II r + - = 2http://www.youtube.com/watch?v=imQnWrLW2i0 6 13V H V H x z y x y IVV IVH IHH IHV Anizotropie r= G faktor charakteristika přístroje G= IVV IVH - +2 x x Poskytnuto Horiba Jobin Yvon IHH IHV IVV IVV IVH IVHG G 6 14 Princip sledování vazby makromolekul Excitace nízká anizotropie vysoká anizotropie t ~ ns Emise 6 15 Interakce protein-DNA KD = 2 . 10-6 M 0,17 0,22 0,27 0,32 0 5 10 15 protein (M) AnizotropieFluorescence 6 16 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 20 40 60 80 100 120 [Protein], M Anisotropy,r Monomery malé rychlá rotace málo omezená nízká anizotropie rychlá depolarizace ("rozorientování") Dimery větší pomalá rotace omezená viskozitou vysoká anizotropie pomalá depolarizace Upraveno podle Horiba Jobin Yvon Sledování vytváření dimerů 6 17 Sledování rozplétání DNA 6 18 Vazba represoru na DNA * TRP represor se po aktivaci tryptofanem váže na DNA a kontroluje syntézu tryptofanu. * Po vazbě TRP na fluoresenčně značenou DNA se zvyšuje anizotropie * Při zvyšující se koncentraci tryptofanu se zvyšuje vazba represoru TRP na DNA a zabraňuje tak další syntéze tryptofanu 6 19 Časově rozlišená anizotropie fluorescence * Měření časově rozlišené anizotropie fluorescence při pulzním buzení poskytuje mnohem více informací o rotačních pohybech fluoroforu, než ustálená fluorescence. * Ustálená fluorescence poskytuje zprůměrované hodnoty měřených parametrů a pro jejich interpretaci je nutno provádět řadu měření při různých teplotách; oproti tomu metodou časově rozlišené polarizace fluorescence získáme potřebné údaje již z měření při konstantní teplotě. * Při použití metody časově rozlišené anizotropie fluorescence se měří časově závislé složky intenzity III (t) a Iv(t). Celková intenzita I(t) = III (t) + 2 Iv(t) přitom nezávisí na rotačním pohybu fluoroforu a měří se pod ,,magickým" úhlem 54,7° 6 20 Jaké informace může dát časově rozlišená anizotropie fluorescence? * Pokud jsou doba dohasínání fluorescence a rychlost molekulární reorientace srovnatelné, potom bude polarizace fluorescence modulována molekulárním pohybem a analýza časové závislosti emisní anizotropie bude poskytovat informaci o anizotropii systému, v němž se fluorofor nachází. * Měření polarizace fluorescence poskytuje informace o molekulární orientaci a pohyblivosti a procesech, které je modulují, např.: 1. interakce protein-DNA 2. interakce ligand-receptor 3. flexibilita biopolymerů 4. fluidita membrán 5. proteolýza 6. kontrakce svalů 7. aktivita proteinkináz 6 21 Perrinova rovnice pro vztah anizotropie a rotace sférických molekul + = >< 1 1 0r r r0 anizotropie v čase 0 doba dohasínání fluorescence rotační korelační čas popisuje rotaci molekul 6 22 Kdy nám může dát časově rozlišená anizotropie informaci o pohybu molekul? = 10 ns 1 = 0.1 ns 2= 10 ns 3 = 1000 ns + = >< 1 1 0r r ? 0 = >< r r Když se pohyb molekul děje v čase srovnatelném s dobou dohasínání fluorescence ~ 0.0009 0.5 0.99 6 23 Použití Perrinovy rovnice pro stanovení vlastností molekul r0 anizotropie v čase 0 doba dohasínání fluorescence rotační korelační čas Dr rotační difůzní konstanta V objem molekuly viskozita prostředí k Boltzmanova konstanta (=1.38 .10-23JK-1) T absolutní teplota V kT D r r r +=+= + = >< 161 1 1 0 6 24 Časová závislost je složitější pro molekuly složitějších tvarů 6 25 Měření časově rozlišené anizotropie * Vzorek je excitován krátkým pulzem s trváním mnohem kratším než doba dohasínání * Změří se dohasínání celkové intenzity při natočení polarizátorů pod magickým úhlem * Změří se dohasínání intenzity při rovnoběžně natočených polarizátorech * Změří se dohasínání intenzity při kolmo na sebe natočených polarizátorech * Podle vztahu pro vypočet anizotropie se křivky složí a získá se časová závislost anizotropie 6 26 Vertikálně a horizontálně polarizovaná složka anizotropie * Závislost anizotropie je vypočtena z časové závislosti vertikálně a horizontálně polarizované emise. * V případě, že jsou absorpční a emisní momenty přechodu rovnoběžné, je počáteční anizotropie r0=0.4 * Horizontáloně polarizovaná emise klesá pomaleji 6 27 Změna rotačního korelačního času při multimerizaci proteinu * Časové závislosti anizotropie fluorescence lze použít při sledování změny dynamiky systému molekul * Sledování multimerizace fosfofruktokinázy 0 10 20 30 40 Čas (ns) logr(t) = 5 ns = 20 ns M T logr(t) 6 28 Flexibilita DNA * Jak závisí ohebnost DNA na okolních podmínkách? * Jaký je nejmenší průměr póru, kterým může DNA projít ? http://www.ks.uiuc.edu/Research/nanopore/ PICTURES/ds2.0-V3.2.mpg 6 29 Sledování pohybu DNA po interkalaci EtBr * Po zvýšení iontové síly (čárkovaně) dochází ke zpevnění struktury DNA * První část křivky dohasínání fluorescence popisuje torzní pohyb DNA * Pozdější část křivky popisuje ohyb DNA struktur 6 30 Srovnání měření ustálené a časově rozlišené intenzity a anizotropie IntenzitaI Vlnová délka Anizotropier Čas (min) logI(t) Ustálená Časově rozlišená Více informací! čas (ns) logr(t) čas (ns) Pulzní buzení 6 31 Literatura * Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. * Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem Poděkování