7 1 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul 8.11.2007 7 2 UV spektroskopie DNA a proteinů * Všechny atomy absorbují v UV oblasti spektra, protože toto záření má dostatečnou energii k excitaci vnějších elektronů * UV spektroskopie je používána k určení koncentrace DNA a proteinů a k určení poměru DNA/proteinů v roztoku * Ke stanovení koncentrace biologických molekul se využívá Lambert-Beerův zákon 7 3 Lambert-Beerův zákon * Látka pohlcuje světlo * Pro absorpci monochromatického světla * Lambert-Beerův zákon: Absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce vrstvy roztoku lc II = 100 I I lcA 0 10log== =molární extinční koeficient látky, c-koncentrace, l-délka optické dráhy 7 4 Absorpční spektrum DNA * Spektrum DNA je tvořeno příspěvky jednotlivých bazí * Nejvíce absorbují heterocyklické puriny A,G méně C,T, * Absorbance DNA se měří v maximu tj. při 260 nm * Poměr A260/A280 je pro čistou DNA 1.8 * Poměr menší než 1.8 ukazuje na přítomnost proteinů nebo nečistot Abs (nm)260 280 7 5 Přibližné určení koncentrace nukleových kyselin * Jestliže má roztok NK Abs 260=1 v 1 cm kyvetě, pak je koncentrace * dvouřetězcové dsDNA 50 g/ml * jednořetězcové ssDNA 30 g/ml * jednořetězcové RNA 40 g/ml * Odtud můžeme vypočítat molární koncentraci pomocí průměrné Mr nukleotidů (320) * Takto vypočtená koncentrace se vztahuje na 1 nukleotid! * Pro přepočet koncentrací platí 320 g/ml ~ 1 mM * Jedná se molární koncentraci nukleotidů v roztoku! 7 6 Určování extinkčního koeficientu oligonukleotidů * Měřením ­ Analytické stanovení Fosforová analýza * Výpočtem ­ nejpřesnější na základě sekvence s uvážením vlivu sousední báze lcA = 7 7 Fosforová analýza při stanovení koncentrace DNA * Přesná analytická metoda * Určuje koncentraci fosfátových skupin * Před analýzou je nutno štěpit DNA * Umožňuje určit také u analogů DNA a při modifikaci DNA např. fluorescenčními značkami * Využívá kolorimetrie ­ stupeň zbarvení roztoku je přímo-úměrný množství PO4 (tj. množství DNA) Murphy, J.H. and Trapane, T.L.,1996, Analytical Biochemistry, 240, 273-282. 7 8 Výpočet extinkčního koeficientu DNA * Extinkční koeficienty jednotlivých bazí přispívají k výslednému celé DNA podle pravidla nejbližšího souseda * Interakce sousedních bazí ovlivňují míru absorpce * Výpočet extinkčního koeficientu oligonukleotidu o délce n nukleotidů Warshaw, M.M. and Tinoco, I. (1966) Optical properties of sixteen dinucleoside phosphates. J. Mol., Biol., 20: 29-38. Cantor, C.R. and Warshaw, M.M. (1970) Oligonucleotide interactions. Biopolymers, 9:1059-1103 7 9 Příklad výpočtu * M13 sekvenační primer 5'- gTA AAA CgA Cgg CCA gTg -3, = (368 000) ­ (185 400) = 182 800 M-1cm-1 Samostatné báze Nejbližší soused 7 10 Kalkulátory extinkčních koeficientů DNA/RNA oligonukleotidů Výpočet http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/ OligoAnalyzer/Default.aspx 7 11 Jednotka optické hustoty OD OD jednotka optické hustoty (,,optical density") 1 OD je množství DNA nebo proteinu, které když se rozpustí v jednom mililitru, má absorbanci 1, jestliže se měří v kyvetě s optickou dráhou 1 cm. Měření optické hustoty OD se často používá v biologii jako jednoduché metody k určení koncentrace, protože v rozsahu 0..1 platí přibližně lineární vztah mezi koncentrací biologického materiálu a hodnotou absorbance. 7 12 Příklad výpočtu koncentrace DNA = 182 800 M-1cm-1 Celkem po syntéze 8,5 OD260 Přidáme 500 ul H2O Jaká je molární koncentrace DNA? c = 93 M Molární koncentrace celých řetězců! 7 13 Hypochromní efekt při tvorbě DNA * Dvouřetězcová DNA absorbuje DNA méně, než jednořetězcová a ta méně než samotné nukleotidy * Využití: Sledování rozplétání komplementárních řetězců Snižování absorbance : Abs (nukleotidy) >Abs (ssDNA) >Abs (dsDNA) Abs (nm) 7 14 Sledování tání DNA * Denaturační křivka DNA - závislost absorbance (260nm) na teplotě * Teplota tání Tm - teplota, při které je právě polovina molekul zdenaturována Abs(260) Teplota (°C) Tm + 7 15 Kalkulátor teplotní stability DNA Výpočet teploty tání a její závislosti na koncentraci oligonukleotidu a solí http://www.basic.northwestern.edu/biotool s/oligocalc.html 7 16 Absorpční spektrum proteinů * Spektrum proteinů je tvořeno příspěvky jednotlivých aminokyselin * Nejvíce absorbují tryptofan, tyrosin a cystein * Absorbance proteinu se měří při 280 nm 7 17 Spektroskopické stanovení koncentrace proteinu Analytické určení Bradfordové metoda - změna absorpčního maxima v přítomnosti proteinu Výpočet extinkčního koeficientu na základě sekvence aminokyselin 7 18 Bradfordové metoda určování koncentrace proteinu * Metoda je založena na jevu posunu absorpčního maxima kyselého roztoku Coomasie Brilliant Blue G-250 z 465 nm na 595 nm při vazbě na protein. Změna je způsobena iontovými a hydrofobními interakcemi s proteinem, které stabilizují záporně nabitou formu barviva, což má za následek změnu barvy roztoku. * Rozsah použití metody je řádově 0.1 ­ 1.5 mg/ml * V tomto rozsahu nedochází k výrazné změně extinkčního koeficientu komplexu protein/Coomassie Bradford, MM. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976. Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990). 7 19 Coomasie Další názvy: Coomassie Blue, Brilliant Blue, Brilliant Blue G, Acid Blue 90, C.I. 42655, Brilliant Blue G 250, or Kunasty Blue Jméno podle Afrického města Kumasi v Ghaně Původně byla tato látka používána v textilním průmyslu k barvení vlny 7 20 Praktické provedení stanovení koncentrace proteinu * Připraveny standardy BSA (hovězí sérový albumin nebo Imunoglobulin G) v rozsahu 0.125...1.5 mg/ml * Po přidání roztoku Coomasie (např. 980 l + 20 l roztoku proteinu) a krátké inkubaci (5 min) se měří Abs při 595 nm * Na základě kalibrační křivky se stanoví koncentrace vzorku * Nejpřesnější stanovení v oblasti 0.2 ­ 0.7 mg/ml 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 0,5 1 1,5 2 protein (mg/ml) Abs(595nm) 7 21 Absorpční densitometrie gelů * Při analýze molekul v gelu je možno získat současně informace o kvalitě i kvantitě * Měří se množství absorbovaného světla v závislosti na 2D poloze * Stanovení koncentrace DNA a proteinu po barvení gelu Coomasie nebo stříbrem Zdroj světla Detektor Optická hustota (Abs) 7 22 Výpočet extinkčního koeficientu proteinu Celk = počet(Tyr).Tyr + počet(Trp).Trp + počet(Cystein).Cystein * Extinkční koeficienty pro proteiny měřené ve vodě při 280 nm: Tyr = 1490, Trp = 5500, Cystein = 125 Gill, S.C. and von Hippel, P.H. (1989). Anal. Biochem. 182:319-326(1989). http://www.expasy.org/tools/protparam.html 7 23 Cirkulární dichroismus ve strukturní analýze molekul * Cirkulární dichroismus je způsoben asymetrií molekulárních struktur. * Součástí biologických molekul jsou opticky aktivní molekuly cukrů a aminokyseliny * V případě uspořádání monomerních jednotek do šroubovice dochází k výraznému zesílení optické aktivity celé makromolekuly * Optická aktivita roztoků biologických molekul je použita k popisu jejich struktury a zejména strukturních změn 7 24 Princip CD * Látka je opticky aktivní, jestliže stáčí rovinu polarizovaného světla * Rovinně polarizované světlo si můžeme rozložit na levotočivou a pravotočivou složku kruhově polarizovaného světla. * Levotočivá složka kruhově polarizovaného světla prochází prostředím jinou rychlostí (má jiný index lomu n) než pravotočivá je složka kruhově polarizováného světla => dojde ke stočení roviny polarizovaného světla * Levotočivá složka kruhově polarizovaného světla je absorbována jinak než pravotočivá složka kruhově polarizováného světla => dojde ke změně z rovinně polarizovaného světla na elipticky polarizované * Cirkulární dichroismus je definován jako rozdíl extinkčního koeficientu pro levo- a pravo-točivou složku kruhově polar.světla CD = =L+ P * často se měří elipticita - ve stupních * Stočení roviny polarizovaného světla a charakterizace elipticky polarizovaného světla dává informaci o struktuře molekul v roztoku 7 25 Rozklad rovinně polarizovaného světla na kruhově polarizované složky http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo0.htm 7 26 Změna polarizace v asymetrickém prostředí * V prostředí, kde se levotočivě kruhově pol. světlo pohybuje jinak než pravotočivě, dochází ke změně vzájemného posunu kruhově polarizovaných složek, což způsobí stočení roviny polarizace. * V případě že se liší také absorpce levo- a pravo- kruh. pol. světla vzniká elipticky polarizované světlo 7 27 Elipticita Elipticita je ůhel, který charakterizuje míru změny rovinně polarizovaného světla na elipticky polarizované. Jestliže je světlo rovinně polarizováno =0 Jestliže je světlo kruhově polarizováno =45 ° )(298.3 ][ 180 )( 4 303.2 tan PL PL LR LR EE EE -= °-= + - = ER vektor elektr. Intenzity pravotočivě pol. složky EL vektor elektr. Intenzity levotočivě pol. složky 7 28 Princip CD * Látka je opticky aktivní, jestliže stáčí rovinu polarizovaného světla * Rovinně polarizované světlo si můžeme rozložit na levotočivou a pravotočivou složku kruhově polarizovaného světla. * Levotočivá složka kruhově polarizovaného světla prochází prostředím jinou rychlostí (má jiný index lomu n) než pravotočivá je složka kruhově polarizováného světla => dojde ke stočení roviny polarizovaného světla * Levotočivá složka kruhově polarizovaného světla je absorbována jinak než pravotočivá složka kruhově polarizováného světla => dojde ke změně z rovinně polarizovaného světla na elipticky polarizované * Cirkulární dichroismus je definován jako rozdíl extinkčního koeficientu pro levo- a pravo-točivou složku kruhově polar. světla CD = =L+ P * často se měří elipticita - ve stupních * Stočení roviny polarizovaného světla a charakterizace elipticky polarizovaného světla dává informaci o struktuře molekul v roztoku 7 29 Využití CD spektroskopie * Určování sekundární struktury biomakromolekul * Stanovení poměrného zastoupení jednotlivých konformací ( šroubovice, list u proteinů) * Sledování již nepatrných strukturních změn * Strukturní přechody DNA (A,B,Z) a proteinů * Určování teplotní stability * Sledování interakce protein ­ protein, protein-DNA * Sledování terciální struktury proteinů 7 30 CD spektroskopie DNA http://www.ibp.cz/labs/CD-SNA/index.htm Vorlíčková, M., Kypr, J. and Sklenář, V.: NUCLEIC ACIDS: (c) SPECTROSCOPIC METHODS, Encyklopedia of Analytical Science, vol. 6, sec. ed., Elsevier, Oxford, (2005) 391-399