Souhrn předchozí přednášky Cvičení: 14. a 18.12., A7 (2.17) - pláště, psací a kreslící potřeby • Regulace transkripce – Gal4 transkripční faktor • transkripční hybridní systémy – alternativní kvasinkové systémy • hybridní – G-proteiny • komplementační – DHFR, ubikvitin Osnova (poslední) přednášky • Chromatin – Charakteristika kvasinkového genomu – Chromosomy • chromatinové domény • SMC komplexy – Evoluce (duplikace genomu …) – DNA-opravné mechanismy • NHEJ • Homologní rekombinace – SMC komplexy a struktura chromatinu • Závěry Saccharomyces cerevisiae (vs S.p.) - haploidní genom - 12Mbp, 16 chromosomů (chrI=0.22 – chrXII=1.6Mbp) - délka chromosomu XII se u různých S.c. liší dle počtu (až 200) kopii rDNA v repetici, 262 tRNA (pro 64 kodonů), 40 snRNA, - Krátké centromery a ARS (100bp) - Geny (cca 6500) reprezentují 75% celkové sekvence (kompaktní) - Redundantní (2000 genů duplikováno) – cca30% genomu vzniklo duplikacemi - <5% genů (280) obsahuje introny (0.5% genomu), - 3% Ty1-5 transposony (46% u člověka) - Kondenzovaný/tichý heterochromatin: centromery, telomery a HMR/HML Základní prvky kvasinkového genomu Chromosom III CEN=centromera ARS=autosomal replicating sequence TEL=telomery tRNA Ty transposony MAT a HML/HMR lokusy Heterochromatin: centromera telomery HMR a HML (MAT je aktivní určuje haplotyp) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5213-5218. Pozorování DNA/chromosomů u kvasinek • Chromosomy jsou u kvasinek malé a těžko pozorovatelné v mikroskopu – barvení DNA na fixovaných preparátech pomocí DAPI (4 ,6-diamidino-2- phenylindole) • Použití fůzních proteinů-GFP (green fluorescence protein) pro studium dynamiky chromatinu (H2A-GFP, kinetochora-centromera) • TetR-GFP represor se váže na TetO sekvence (operon) zaintegrované v přesně definovaném lokusu • ChIP (chromatin immune precipitation) – specifické sekvence, ChIP-seq nebo „ChIP on CHIP“ • 3C – chromatin conformation capture Saccharomyces cerevisiae Schizosaccharomyces pombe Pozadí = mtDNA - zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze tj. replikace - rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze - jádro se protahuje – začátek M fáze (u kvasinek se jaderná membrána nerozpadá) - na začátku anafáze dochází k oddělení sesterských chromatid a jejich segregaci SPB-GFP barvení DNA v průběhu buněčného cyklu S.cerevisiae MT-cytoplasmatické -jaderné Marco et al, Cell, 2013 Orientace chromosomů FISH – fluorescence in situ hybridization (1992) Tadei a Gasser, Genetics, 2012 rDNA (repetice) SPB v mitotickém jádře jsou centromery orientovány (přichyceny) k SPB (spindle pole body) v meiotickém jádře jsou telomery blíž SPB 3D organizace chromosomů v S.c. 3C – chromosome conformation capture Duan et al, Nature, 2010 Chromosom III Duan et al, Nature, 2010 Diagram ukazuje víceméně rovnoměrnou distribuci smyček (prostorově sousedících úseků DNA) – napovídá o prostorovém uspořádání chromosomu III Duan a spol, Nature, 2010 Chromosom XII obsahuje rDNA repetice, které jsou lokalizovány do jadérka – úsek nesousedí s žádnou z „jaderných“ částí – je izolován (z „bezpečnostních“ důvodů – aby nedocházelo k homologní rekombinaci mezi „homologními“ repeticemi) Chromosom XII Duan a spol, Nature, 2010 Všechny centromery jsou blízko sebe v mitotickém jádře jsou centromery orientovány (přichyceny) k SPB (spindle pole body) 3D rekonstrukce chromosomů v kvasinkovém jádře Syntetické raménko kvasinkového chromosomu Syntetické raménko vytvářeno postupně (cca 10kbp fragmenty) – střídavě URA3 vs LEU2 markery pro selekci nových kmenů Dymond et al, Nature, 2011 • Zachováno pořadí genů … wt fenotyp (testovali UV, H2O2 …) • Odstraněny destabilizující repetitivní elementy (telomery, transposony) • Redundantní tRNA (z 275 kopii na 42 kódujících – na extrachromosom) • TAG na TAA stop kodony (TAG kodon uvolněn pro novou AMK) • unikátní PCRtagy (odlišení syntetického a wt chromosomu) • LoxPsym na vyštěpení non-essenciálních genů Syntetické raménko kvasinkového chromosomu Dymond et al, Nature, 2011 • Zachováno pořadí genů … wt fenotyp (testovali UV, H2O2 …) • Odstraněny destabilizující repetitivní elementy (telomery, transposony) • Redundantní tRNA (z 275 kopii na 42 kódujících – na extrachromosom) • TAG na TAA stop kodony (TAG kodon uvolněn pro novou AMK) • unikátní PCRtagy (odlišení syntetického a wt chromosomu) • LoxPsym na vyštěpení non-essenciálních genů Syntetické raménko kvasinkového chromosomu Dymond et al, Nature, 2011 • Zachován fenotyp (teplotní citlivost, morfologie kolonií, růst na G/E …) SC=Syntetické kompletní médium SD=Syntetické minimální medium GE=glycerol/etanol • přestože jsou si druhy morfologicky podobné a mají podobný životní styl • % odlišnost sekvence proteinů: – S. cerevisiae a C. glabrata ~ člověk a ryba – S. cerevisiae a Y. lipolytica ~ člověk a sumka – mezi druhy S. sensu stricto ~ mezi řády savců – Proteiny člověka a hlodavců jsou si více podobné než proteiny druhů ze skupiny sensu stricto, mezi nimiž můžou vznikat životaschopné hybridy! • Lze srovnat genomy čl., krysy, myši a kuřete a lze rekonstruovat změny, jimiž genomy během evoluce od společného předka prošly. • Genomy kvasinek ze vzdálenějších větví fylogenetického stromu takto srovnat nelze. • Potvrzeno studiemi rDNA, nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. Evoluce kvasinek Obr. 3. Srovnání průměrné % shody sekvence proteinů v taxonech Saccharomycotina a Chordata Saccharomycotina Chordata AscomycotaBasidiomycota • 1500 Mya: Metazoa - Fungi • 1200 Mya: Ascomycota – Basidiomycota. • 1000 Mya: S. cerevisiae – Schizosacch. pombe • 840 Mya: S. cerevisiae – C. albicans • 170 Mya: (Pichia, Candida) – Kluyveromyces aj. • 150 Mya: WGD Evoluce kvasinek cca 30% genomu S.c. vzniklo duplikacemi => cca 2000 genů duplikováno nebo došlo k celogenomové duplikací (WGD) => a poté došlo k přeskupování a redukci segmentů (i chromosomů) – 30% genomu u S.c. je pozůstatkem celogenomové duplikace (nikoli duplikace segmentů či genů) Celogenomová duplikace – Saccharomycotina Ancestrální chromosom Evoluce kvasinkového genomu • srovnání kvasinkových genomů ukázalo na existenci „prakvasinky“ s 8-mi ancestrálními chromosomy (cca 4500 geny) • nejblíže anc. genomu je Lachancea kluveri (8 chromosomů, nejméně = 15 přeskupení v genomu - viz a-o) Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 • ancestrální kvasinka prošla celogenomovou duplikací (WGD) 8->16 chromosomů • •některé kvasinky některé chromosomy ztratili (např. C.glabrata = 3 chromosomy) Evoluce centromer Přeskupování chrom. bloků u L.kluveri Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 15 přeskupení (a-o) Přeskupování chrom. bloků u L.kluveri Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 • přeskupení prostřednictvím rekombinace (mikrohomologií) • L.k. neztratil chromosom patrně způsobeno absencí genů DNL4, POL4, NEJ1 – důležité pro NHEJ mechanismus (oprava poškozené DNA např. dvouřetězcových zlomů, které jsou nutné pro fůze chromosomů i přeskupovaní => omezené přeskupování) 15 přeskupení (a-o) Redukce chromosomů telomera-telomera fúzemi Zygosaccharomyces rouxii ztratila 1 chromosom díky telomera-telomera fůzi 2 ancestrálních chromosomů - současně ztratily centromeru (chromosom nemůže mít 2 centromery – problémy se segregací) Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 Gordon et al., PLoS Genetics, 2011 - rozlomení v centromeře a napojení vzniklých ramen na telomery jiných chromozomů (A. gossypii) - geny v oblasti telomer (neesenciální, málo transkribovány, malý evoluční tlak - mutují více než ostatní geny - telomery jako „kotlík“ evoluce = cooking pots of evolution) - při fúzi chromozomů se geny z telomerových oblastí dostávají dovnitř chromozomu (změna míry exprese uvnitř chromozomu) Redukce chromosomů telomera-telomera fúzemi Struktura kvasinkových telomer Lowell et al., Cell Mol Life Sci (1998), p.32 300bpRepetice ~5.5kbp Telomery umlčují transkripci – ADE2 reporter je pod kontrolou telomer pouze občasně náhodně transkribován Cohen et al., Curr Genetics (1998) E. Blackburn, Nobelova cena, 2009 Represe u kvasinkových telomer - struktura telomery a subtelomery umlčuje transkripci (silencing) - ADE2 reporter je pod kontrolou telomer pouze občasně náhodně transkribován - např. HML a HMR lokusy jsou umlčené (pouze MAT lokus určuje párovací typ) Heterochromatin: centromera telomery HMR a HML (MAT je aktivní určuje haplotyp + - telomera Represe u kvasinkových telomer Heterochromatin: centromera telomery HMR a HML (MAT je aktivní určuje haplotyp Sir proteiny (deacetylasy atd. – umlčují/kondenzují chromatin) Est1p … telomerasa zodpovědná za replikaci/prodlužování telomer Centromera S. cerevisiae - Sekvenčně specifická centromera se patrně vyvinula z původně repetitivní/sekvenčně nespecifické centromery Konsensní sekvence S.c. centromer Chan et al., Trends in Cell Biol, 2005 Centromera S. cerevisiae Chan et al., Trends in Cell Biol, 2005 - pouze 3 chromozomy (13 Mbp = 3.5, 4.6, 5.7) - velké repetitivní centromery (40-150kb) a 1kb počátky replikace Reinhardt a Bartel, Science, 2002, http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/main7.html Centromera S. pombe Carroll a Straight, Trends in Cell Biol, 2006 Centromera S. pombe Centromery jsou definovány více strukturou chromatinu než jejich sekvencí rDNA - repetice • rDNA kóduje geny pro ribosomální RNA (chromosom XII) • Je vysoce konzervativní • Identifikace a odlišování kvasinkových druhů • Sledování evolučních trajektorii • Až 200 kopii v řadě za sebou • Problém s homologní rekombinací (lokalizace do jadérka) • Problém s replikací – musí probíhat ve stejném směru jako transkripce (probíhá v S-fázi – kolize) Homologní rekombinace 1. MRX se váže na zlomené konce DNA. 2. Nukleolytická degradace 5’ řetězců 3. Vazba RPA na 3’ jednovláknové konce 4. Rad52 nakladá Rad51 rekombinázu na ssDNA (Srs2 helikáza odstraňuje Rad51). 5. Rad51-filament hledá homologní DNA (Rad54). 6. Tvorba D-smyčky 7. Prodloužení 3´ konce filamentu (DNA polymeráza δ) 8. Vznikají dvě „Holiday junctions“ rozrušený Sgs1-Top3-Rmi nebo rozštěpený endonukleázami (Mus81-Mms4, Slx1-Slx4, Rad1Rad10, Yen1). Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 HR nutný pro opravu DSB, přepínání párovacího typu, restart zastavených replikačních vidliček, integraci DNA do genomu ale je nebezpečný pro repetitivní sekvence Nehomologické spojování konců Non-homologous end joining (NHEJ) Upravené z Altmannová et al., Biomolecules, 2012 1. Vazba MRX (Mre11-Rad50-Xrs2) komplexu, Ku heterodimeru (Yku70Yku80) na zlomené konce DNA 2. Vazba DNA ligázy IV (Dnl4) a jejích pomocných proteinů Lif1 a Nej1. 3. Hledání komplementarity mezi převisy dvou konců DNA. 4. Úprava konců - syntéza DNA (Pol4 DNA polymeráza) 5. Religace konců při opravě nekompatibilních konců většinou dochází k delecím nebo inzercím – HR je lepší, ale je potřeba homologní sekvence – NHEJ v G1 zatímco HR v G2/M – dobře rostoucí kultura kvasinek má významnou frakci buněk v G2/M (proto je v kvasinkách možná integrace homologních sekvencí – genetika – použít exponenciální kultury pro transformace) SMC6 SMC5 SMC komplexy napomáhají při HR - kohesin přidržuje homologní chromosomy při sobě a napomáhá HR - SMC5/6 reguluje restart zastavených replikačních vidliček (limituje HR v repetitivních sekvencích) Kohesin „objímá” DNA SMC1 Scc1/Rad21 SMC3 Scc3 Marco et al, Cell, 2013 Haering et al, 2002, Mol Cell Kohesin je klíčový pro průběh mitosy – otevření kruhu v anafázi umožňuje segregaci Souhrn přednášky • Chromatin – Charakteristika kvasinkového genomu – Chromosomy • chromatinové domény • SMC komplexy – Evoluce (duplikace genomu …) – DNA-opravné mechanismy • NHEJ • Homologní rekombinace – SMC komplexy a struktura chromatinu • Závěry Přehled - závěry Úvod – historie, význam Základní charakteristiky kvasinek Kvasinky a biotechnologie Diagnostické a molekulárně biologické metody Genetika kvasinkových organismů Morfologie a buněčný cyklus, párovací proces, Protoplasty kvasinek jako modelový objekt Struktura kvasinkové buňky, sekreční dráhy a endocytóza Patogenní kvasinky, morfologická charakteristika, medicínské aspekty Regulace transkripce, 1-2-3 hybridní systémy, reporter systémy Organizace kvasinkového chromatinu