RNDr. Pavel Babica, Ph.D. Studium Ekotoxikologie na PřF MU v Brně Environmentální toxikologie a in vitro toxikologie Toxikologie ¤Studium škodlivých účinků chemických látek na živé organismy: ¤symptomy, mechanismy a léčba otrav, stanovení „bezpečné“ dávky ¤Průmyslová toxikologie ¤Farmaceutická toxikologie ¤Toxikologie potravin ¤Klinická toxikologie ¤Soudní (forenzní) toxikologie ¤Radiační toxikologie ¤Vojenská toxikologie ¤Ekotoxikologie ¤Toxikologie životního prostředí ¤ (environmentální toxikologie) ¤ n n ¤ ¤ ¨ C:\Users\babica\Desktop\danger-160024_960_720.png RECETOX, PřF, MUNI Bc. / Mgr. / Ph.D. Ekotoxikologie Environmentální toxikologie soil factory5 city2 Traktor4 truck3 PLANE5 Chronická onemocnění Ø Rakovina Ø Chronická onemocnění dýchacího traktu Ø Autoimunitní onemocnění Ø Poruchy plodnosti Ø Neurodegenrativní a neurovývojové poruchy Family-Silhouette-clip-art http://clipartist.net/RSS/openclipart.org/2012/October/cloud-1979px.png http://img.tesco.com/todayattesco/images/green/big-blue-horizons/tap-illustration.gif http://nurseweb.villanova.edu/womenwithdisabilities/other/food.gif http://images.neopets.com/items/gro_fyora_shampoo.gif Vzduch Voda Půda Potraviny Farmaka ??? Kosmetické přípravky http://www.clker.com/cliparts/0/5/1/1/11949850711909146976smoke_nicu_buculei_02.svg.hi.png http://blog.23andme.com/wp-content/uploads/2010/11/cartoon-pills-300x284.png Akutní efekty http://r1.emsworld.com/files/base/image/EMSR/2014/03/16x9/640x360/drinking-ce0314_11323328.jpg C:\Users\babica\Desktop\1405787885.jpg C:\Users\babica\Desktop\1429773044004.jpg C:\Users\babica\Desktop\20120107-171945.jpg > Metody výzkumu toxikologie ¨Pozorování Experiment C:\Users\babica\Desktop\374beec.jpg C:\Users\babica\Desktop\systematic-observation-psychology_62ca7bb505ed13ff.jpg Metody výzkumu toxikologie C:\Users\babica\Desktop\british-countryside.jpg C:\Users\babica\Desktop\industrial_E008753-720x340.jpg Pozorování Epidemiologické studie: Case-control studies (případ-kontrola) C:\Users\babica\Desktop\2048x1365.jpg C:\Users\babica\Desktop\Healthy_People_2020-1.jpg C:\Users\babica\Desktop\NEW children_linedup2.jpg Metody výzkumu toxikologie Pozorování Epidemiologické studie: Longitudinal studies (dlouhodobé opakované sledování) Metody výzkumu toxikologie ¨Pozorování Experiment C:\Users\babica\Desktop\374beec.jpg C:\Users\babica\Desktop\systematic-observation-psychology_62ca7bb505ed13ff.jpg Metody výzkumu toxikologie Experiment účinky na člověka – experimenty na lidech? Relevantní, cílový Organismus þ Eticky nepřijatelné ý Dnes ¤Historicky – objevování jedů – lov, travičství nStarověká Indie, Řím – ochutnávači => testování toxicity nKleopatra – služebnictvo: rulík, blín, nebo kulčiba (strychnin) ¤Vězni, chudina, nemocní, postižení, minority ¤2. svět. válka: Německo, Japonsko (Unit 731) ¤USA nVanderbilt Experiment (1944-1974) – těhotné a radioaktivní železo nArmádní pokusy ve 40. tých letech – lewisit, hořčičný plyn, radioaktivita (1944-1962) nOperation Whitecoat (1954-1973) – účinky chemických a biol. zbraní nCIA projekt MK-ULTRA (1947-1973) – vliv LSD na psychiku nHolmesburg prison, PA (60. léta) – testování léků, dioxinů ¤SSSR, Severní Korea Toxikologické experimenty na lidech ¤Norimberský protokol 1947 ¤Pouze pokusy nedosažitelné jinými metodami ¤Nezpůsobovat zbytečné utrpení a zranění ¤Nezpůsobovat smrt nebo dlouhodobém zranění či nemoc ¤Pokus by měl být ukončen pokud hrozí zranění, zmrzačení či smrt ¤WHO - Helsinská deklarace 1964, USA – Belmontský report 1978 ¤XXX ¤Toxikologie – zkoumá škodlivé účinky, schopnost látek poškozovat zdraví organismu Toxikologické experimenty na lidech Experimentální toxikologie ¤Experimentální metody (prediktivní) ¤Experimenty s živými organismy – in vivo nČlověku blízké druhy – savci (hlodavci, prasata, primáti) ¤Experimenty s částmi živých organismů ¤ - ex vivo & in vitro & in chemico nIzolované orgány nTkáňové kultury nBuněčné organely a extrakty nPurifikované biomakromolekuly ¤Počítačové simulace a modelování – in silico ¤ ¨ OECD TG / Description 401 Acute oral toxicity, LD50 402 Acute dermal toxicity 403 Acute inhalation toxicity 404 Acute dermal irritation / corrosion 405 Acute eye irritation 406 Skin sensitisation 407 Repeat dose oral toxicity (28 days), rodents 408 Repeat dose oral toxicity (90 days), rodents 409 Repeat dose oral toxicity (90 days), non-rodents 410 Repeat dose dermal toxicity (21/28 days), rodents Experimentální metody (prediktivní) ¤Experimenty s živými organismy – in vivo nČlověku blízké druhy – savci (hlodavci, prasata, primáti) nZáklad toxikologie ve 20. století – normované testy OECD/EU 411 Repeat dose dermal toxicity (90 days), rodents 412 Repeat dose inhalation toxicity (28 days), rodents 413 Repeat dose inhalation toxicity (90 days), rodents 414 Prenatal development toxicity (teratogenicity) 415 One generation reproduction toxicity 416 Two generation reproduction toxicity 417 Toxicokinetics 418 Delayed neurotoxicity of organophosphates (acute) 419 Delayed neurotoxicity of organophosphates (28 day repeat dose) Experimentální toxikologie Etické důvody Relevance a spolehlivost Pokrok v technologiích Ekonomická a časová náročnost 6.5% 7.8% 9.9% 8.5% 8.7% Liebsch et al. 2011 Arch Toxicol; 2nd-6th Report from the Commission to the Council and the European Parliament on the Statistics on the number of animals used for experimental and other scientific purposes EU15 EU15 EU15 EU25 EU27 EU 2005 Toxikologie ale odpovídá až za 70% těch nejbolestivějších experimentů (dávky jedů způsobující smrt atd.) ¨Eticky kontroverzní - tlak odborné i laické veřejnosti ¨ ¨1959: Russel & Burch: “3Rs principle” ¨Replacement ¤nahrazení in vivo experimentů alternativními metodami ¨Reduction ¤snížení počtu zvířat pro zjištění požadovaných informací ¨Refinement ¤snížení utrpení - alternativní parametry vyhodnocení ¨ ¨Pricnip 3R silně akcentován v EU ¤podpora výzkumu, validace a implementace alternativních metod In vivo experimenty a etika ¨Direktiva „On the protection of animals used for scientific purposes“ 86/609/EEC a 2010/63/EU ¨„Cosmetic Directive“ 76/768/EEC a 1223/2009 ¨Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (Regulation EC No. 1907/2006) – REACH ¨Biocides Regulation 528/2012 ¨ECVAM – European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing (EURL-ECVAM) In vivo experimenty a etika C:\Users\babica\Desktop\1a504c9e-c3b9-4d8d-9b0e-3afe9d84a010.jpg In vivo experimenty a spolehlivost Cca 20-40% léků testovaných na hlodavcích vykazuje nežádoucí toxické účinky v klinických studiích Cca 50% léků testovaných na hlodavcích nevykazuje požadované účinky v klinických Pouze 5% léčiv vstupujících do klinických studií se dostane na trh Náklady na vývoj jednoho léku činí v průměru 4 miliardy dolarů Hartung, 2013, Altex 30 ¤Experimentální metody (prediktivní) ¤Experimenty s živými organismy – in vivo nČlověku blízké druhy – savci (hlodavci, prasata, primáti) ¤Experimenty s částmi živých organismů ¤ - ex vivo & in vitro & in chemico nIzolované orgány nTkáňové kultury nBuněčné organely a extrakty nPurifikované biomakromolekuly ¤Počítačové simulace a modelování – in silico ¤ ¨ Experimentální toxikologie – 21. století Experimentální metody (prediktivní) ¤Experimenty s živými organismy – in vivo nČlověku blízké druhy – savci (hlodavci, prasata, primáti) ¤Experimenty s částmi živých organismů - ex vivo & in vitro & in chemico nIzolované orgány nTkáňové kultury nBuněčné organely a extrakty nPurifikované biomakromolekuly ¤Počítačové simulace a modelování – in silico ¤ ¨ + použití moderních technologií * Buněčná biologie * Tkáňové kultivace * Molekulární biologie * Omikové metody * Bioinformatika * Modelování * Miniaturizace * Robotizace Experimentální toxikologie – 21. století C:\Users\babica\Desktop\20183-72.JPG U.S. EPA + National Institute of Health et al. ¨Tox21 - http://www.epa.gov/ncct/Tox21/ ¤10 000 látek testováno v 50+ různých in vitro testech ¨ToxCast - http://www.epa.gov/ncct/toxcast/ ¤cca 2000 látek ¤700+ testů, 300 signálních drah ¨ Experimentální metody (prediktivní) ¤Experimenty s živými organismy – in vivo nČlověku blízké druhy – savci (hlodavci, prasata, primáti) ¤Experimenty s částmi živých organismů - ex vivo & in vitro & in chemico nIzolované orgány nTkáňové kultury nBuněčné organely a extrakty nPurifikované biomakromolekuly ¤Počítačové simulace a modelování – in silico ¤ ¨ Experimentální toxikologie + použití moderních technologií * Buněčná biologie * Tkáňové kultivace * Molekulární biologie * Omikové metody * Bioinformatika * Modelování * Miniaturizace * Robotizace Buněčná in vitro toxikologie C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg ¤Primární buňky ¤- zvířecí: mezidruhová variabilita, Hayflick / senescence, etické problémy ¤- lidské: limitovaná dostupnost, heterogenita / nízká reprodukovatelnost ¤Permanentní buněčné linie ¤- lidské: 1951 – HeLa (cervikální karcinom) ¤- dnes dostupné desítky linií z různých orgánů -většinou nádorového původu – genetické a epigenetické změny, abnormální vlastnosti – abnormální odezva? ¤ ?Relevance pro normální tkáně a orgány? - Alternativy? C:\Users\babica\Desktop\hallmarks-10.png sebeobnova sebeobnova self-renewal Terminálně diferencované buňky Izolace & Reprogramování (2007 - člověk) Izolace (1998 - člověk) Indukované pluripotentní buňky (iPSC) Izolace (1997 - člověk) Embryonální kmenové buňky (ESC) Dospělé (tkáňově-specifické)kmenové buňky Dospělé (tkáňově-specifické) kmenové buňky ¤Normální nenádorové buňky organismu ¤ Symetrické (sebeobnova) a asymetrické dělení (diferenciace) ¤Vysoký proliferační potenciál a potence ¤Vývoj protokolů pro jejich in vitro diferenciaci do požadovaných typů buněk Buněčná in vitro toxikologie C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Buněčná in vitro toxikologie C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Fibroblasty dárce / pacienta Blastocysta Jaterní biopsie Reprogramování Indukované pluripotentní buňky Dospělé kmenové buňky Embryonální kmenové buňky Hepatocyte-like cells • Upraveno dle Greenhough 2010, Toxicology 278 Buněčná in vitro toxikologie C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Lidské dospělé jaterní kmenové buňky HL1-1 & HL1-hT1 VIM CD105 CD73 THY1 β-Actin HL1-hT1 p13 HL1-hT1 p55 HL1-1 p2 Buněčná in vitro toxikologie C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Sledování buněčných odpovědí v reálném čase Real Time Impedimetric Analysis C:\Users\babica\Desktop\RTCA-SP-300x228.png Buněčná in vitro toxikologie C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Hepatocytární diferenciace hESCs (spolupráce s Lékařskou fakultou) D0 D5 D10 D15 D20 definitive endoderm hepatic progenitors/ hepatic endoderm immature hepatocytes hepatocytes SOX 17; FOXA2 FOXA2; HNF4α HNF4α; AFP ALB D0 D5 D10 D15 D20 definitive endoderm hepatic progenitors/ hepatic endoderm immature hepatocytes hepatocytes SOX 17; FOXA2 FOXA2; HNF4α HNF4α; AFP ALB Hepatocytární diferenciace hESCs (spolupráce s Lékařskou fakultou) Buněčná in vitro toxikologie C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg CTRL MC-LR 10uM CTRL MC-LR 10uM D10 D20 sebeobnova sebeobnova self-renewal Terminálně diferencované buňky Dospělé (tkáňově-specifické) kmenové buňky Buněčná in vitro toxikologie Efekty na diferencované buňky: Hepatocyty Neurony Kardiomyocyty … Efekty na kmenové buňky Efekty diferenciaci C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg C:\Users\babica\Desktop\643987580af4d27c91830e3a033b00c9.jpg Prenatal development http://images.wisegeek.com/human-fetal-development.jpg Single cell 200 cell types, 37.2 x1012 cells Postnatal development (Bianconi et al., 2013, Annals of Human Biology 40) Healthy or Sick ? ØDiabetes ØCardiovascular diseases ØObesity ØCancer ØImmune system disorders (Asthma, Allergies, IBDs) ØPervasive Developmental Disorders ØNeurodegenerative disorders ØMale Infertility Postnatalní vývoj a dospělost: • Dospělé (somatické, tkáňově specifické) kmenové buňky - tvorba tkání, jejich vývoj, funkce, regenerace • Tkáňová homeostáza: • Udržování ustáleného stavu uvnitř tkáně zahrnující kontrolu buněčné proliferace, diferenciace, smrti a kontrolu metabolických funkcí • Dynamická kontrola aktivity dospělých (somatických) kměnových buněk Cell death Stem cell division Differentiation Transient-amplification Homeostatic balance In humans … it has been estimated that each of us eradicate and, in parallel, generate a mass of cells equal to almost our entire body weight each year. Pelletieri et al.,2007, Annual Review of Genetics Kmenové buňky a tkáňová homeostáza v chronických onemocněních a toxicitě? C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg http://www.eurostemcell.org/stem-cell-factsheets Kmenové buňky a tkáňová homeostáza v chronických onemocněních a toxicitě? C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Mezibuněčná komunikace mezerovými spoji – klíčový mechanismus homeostatické kontroly ¨Gap junction – mezerové spoje ¨Propojení buněk ve tkáních a zajištění výměny metabolitů a signálních molekul: GJIC – gap junctional intercelllular communication ¨Koordinované chování buněk a rovnováha proliferace / diferenciace / apoptózy ¨Narušení GJIC –> abnormální chování buněk –> onemocnění ¨ C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg kontrola 1-methylanthracene Resveratrol+ 1-methylanthracene kontrola Ras-onkogen Ras-onkogen + Metformin Mezibuněčná komunikace mezerovými spoji – klíčový mechanismus homeostatické kontroly C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Animal models • Vysoce komplexní • Limitovaná dostupnost (3R, efektivita, cena) • Rozdílnost od lidského organismu T75 Flask.gif 2D cell cultures • Vysoká proliferační rychlost, uniformita • Nefyziologická 3D cytoarchitektura • Minimum interakcí buňka-buňka / buňka-ECM • Nádorové buněčné linie • Nedostatečně rekapitulují funkce normálních tkání a orgánů 3D cell cultures • Lépe napodobují in vivo mikroprostředí • Gradienty O2/CO2, živin, proliferace • 3D morfologie / polarizace buněk • Interakce buňka-buňka / buňka-ECM • Lépe napodobují funkce normálních tkání a orgánů => Lepší fyziologická / in vivo relevance 3D in vitro kultivace C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg ¨ (Pampaloni et al., 2007, Nature Reviews 8) ¨ 3D in vitro kultivace 3D in vitro kultivace & kmenové buňky In vitro kultury lidských organoidů ¨ (Pampaloni et al., 2007, Nature Reviews 8) ¨ 3D in vitro kultivace •NF •MF •NF/MF •PF C:\Users\Andy\Documents\Osobne\IC\FIRMA\IC letaky a prezentacie\RECETOX testovani HL a WB\DiOC PI Maly konfokal Morphology kit\HL\HL NF d1_01a.tif C:\Users\Andy\Documents\Osobne\IC\FIRMA\IC letaky a prezentacie\RECETOX testovani HL a WB\DiOC PI Maly konfokal Morphology kit\HL\PF\HL PF d1_01.tif Lidské dospělé jaterní kmenové buňky HL1-hT1 a Inomatrix Scaffolds 3D in vitro kultivace C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg ¨ (Pampaloni et al., 2007, Nature Reviews 8) ¨ 3D in vitro kultivace https://resources.rndsystems.com/images/site/pseudocolored-organoid.jpg 3D in vitro kultivace C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Dospělé lidské jaterní kmenové buňky HL1hT1 F:\christmas work\3D\SV\2015_06_22_spheroids_different_cell_density\2015_06_23_24hrs\B4_2000_cells\SNAP-155129-0 278.jpg F:\christmas work\3D\SV\2015_06_22_spheroids_different_cell_density\2015_06_26_96hrs\B4_2000_cells\SNAP-135908-0 279.jpg F:\christmas work\3D\SV\2015_06_22_spheroids_different_cell_density\2015_06_29_168hrs\B4_2000_cells\SNAP-102830- 0275.jpg F:\christmas work\3D\SV\2015_06_22_spheroids_different_cell_density\2015_07_03_264hrs\B4_2000_cells\SNAP-095453- 0276.jpg F:\christmas work\3D\SV\2015_06_22_spheroids_different_cell_density\2015_07_07_360hrs\B4_2000_cells\SNAP-153955- 0275.jpg F:\christmas work\3D\HepG2\2015_07_13\24hrs_2015_07_14\B4\SNAP-092321-0071.jpg F:\christmas work\3D\HepG2\2015_07_13\96hrs_2015_07_17\B4\SNAP-074023-0070.jpg F:\christmas work\3D\HepG2\2015_07_13\2015_07_20\B4\SNAP-093911-0076.jpg F:\christmas work\3D\HepG2\2015_07_13\2015_07_24\B4\SNAP-084007-0070.jpg F:\christmas work\3D\HepG2\2015_07_13\2015_07_27\B4\SNAP-122643-0070.jpg HepG2 lidský hepatocelulární karcinom 24hrs 96hrs 168hrs 264hrs 360hrs 24hrs 96hrs 168hrs 264hrs 360hrs (2000 cells/spheroid) F:\christmas work\CEITEC\IMG_20150812_095727.jpg 3D in vitro kultivace C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg C:\Users\babica\Desktop\zeiss-z1-scope-pix.jpg Alamar Blue CFDA-AM Brightfield 3D in vitro kultivace C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg •Viabilita • Genová exprese – PCR / qPCR • Aktivita proteinů – Western blotting, ICC • Metabolismus – LC-MS > Vehicle Concentration (µM) > 3D spheroids (Alamar Blue, 96 h) Concentration (µM) Vehicle 2D culture (NRU, 96 h) C:\Users\Sabina\Desktop\2015_10_12_MC-LR\2015_10_23_264hrs\A2_MC-LR_10_uM\SNAP-135901-0050.jpg C:\Users\Sabina\Desktop\2015_10_12_MC-LR\2015_10_19_168hrs\A5_Naive\SNAP-122135-0593.jpg C:\Users\Sabina\Desktop\2015_10_12_MC-LR\2015_10_19_168hrs\A2_MC-LR_10_uM\SNAP-121345-0472.jpg C:\Users\Sabina\Desktop\2015_10_12_MC-LR\2015_10_23_264hrs\A5_Naive\SNAP-140636-0167.jpg 0 h 96 h Veh 10 µM 0 h 96 h 4000 cell/sph 168 h old 3D in vitro kultivace C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg ¨ (Pampaloni et al., 2007, Nature Reviews 8) ¨ 3D in vitro kultivace 3D in vitro kultivace C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg screen_shot_2012-09-25_at_103901_am1348533578501 Polarizace buněk a tvorba epiteliálních vrstev - střevo - ledviny - plíce Kokultivace různých buněčných typů - Epiteliální buňky a makrofágy - Leydigovy a Sertoliho buňky ¨ (Pampaloni et al., 2007, Nature Reviews 8) ¨ 3D in vitro kultivace C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg 3D in vitro modely C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg Elektrický dermatom na přípravu kožních štěpů C:\Users\babica\Desktop\thumb-xxxx10_1_600x838.jpg C:\Users\babica\Desktop\getImage.jpg C:\Users\babica\Desktop\fontal-visionmicroette.png Zařízení na měření prostupu látek přes kůži C:\Users\babica\Desktop\epMotion-5075-VAC_with-PC-controller_2.jpg [USEMAP] High-throughput / High content analysis C:\Users\babica\Desktop\recetox-new-fulltext-EN.jpg plate.jpg C:\Users\babica\Desktop\20183-72.JPG Stem cell-based models Homeostasis relevant endpoints in HTS / HCA Physiologically relevant in vitro models QIVIVE Toxicity testing & drug screening KI 67 http://eshop.eppendorfna.com/upload/productView/Eppendorf_epMotion_5075_LH.jpg C:\Users\Andy\Documents\Osobne\IC\FIRMA\IC letaky a prezentacie\RECETOX testovani HL a WB\DiOC PI Maly konfokal Morphology kit\sklo\WB d1 60x_01(2).tif http://www.moleculardevices.com/sites/default/files/products/acuityxpress-fig1a2_450.jpg http://recetox.muni.cz http://secantox.weebly.com