•Biologická technika – zoologická část
•!!! Bezpečnost práce !!!
• – ochranný oděv (plášť) + dlouhé vlasy do gumičky + přezůvky
•
C:\Documents and Settings\Evik\Plocha\blecha.jpg Mikroskop - Mikroskop je dalším zajímavým
klipartem - vektorovým obrázkem. Toto zajímavé dílo je primárně dostupné ve vektorovém
grafickém formátu SVG. Pro velký zájem však obrázek Mikroskop nabízíme i ve formátech JPEG nebo PNG
a to v nejednom rozměru. Pro řadu použití tak vystačíte, doufejme, s
uvedenými soubory - nejsou nutné další konverze a úpravy. Klipart (jednoduchý vektorový obrázek)
nazvaný Mikroskop lze použít do webových prezentací, do wordovských dokumentů, jako
avatar k profilu, apod.
•Michal Benovics

•Co potřebujete na zápočet?
ü100% účast na praktiku (absence         nahrazení)
üOdevzdání protokolů (v následujícím cvičení)
üTest (závěrečné cvičení)
•
•Struktura protokolu:
1.Teoretický úvod (vysvětlení základních pojmů)
2.Postup přípravy preparátů
3.Nákres preparátů měkkou tužkou
4.Popis nákresu – tužkou (velké, nestínovat, nešrafovat)

http://www.sir-ray.com/Mammoth.gif
•Světelná mikroskopie - historie


Čočky a brýle
Nimrudská čočka – 2000 př.n.l. krystal sloužící buď jako zvětšovací sklo nebo k podpalování ohňů,
nebo součást teleskopu
Egypt – 8.stol. př.n.l. – hieroglyfy zobrazují používání čočky
Řecko 1.stol.n.l. – čočka použita pro koncentraci slunečních paprsků a zapálení ohně,
smaragd císaře Nera - korekční pomůcka/sluneční brýle - k pozorování gladiátorských zápasů
Kolem r. 1000 n.l. – tzv. „čtecí kameny“, sférické sklo, pokládaly se na text
První evropské "prabrýle" - čočky korigující vidění zasazené do obrouček - se objevily v Itálii v
druhé části 13. stol. a jako vynálezce je uváděn Alessandro de Spina z Florencie. V té době se
brýle již nějaký čas používaly nejen v Evropě, ale i v Číně, není však známo, na
kterém kontinentu dřív.
http://www.i-bryle.cz/img/18.jpg http://www.i-bryle.cz/img/17.jpg sp-789.jpg (16800 bytes)
•replika kostěných brýlí – 15 stol.

•
•Hans a Zacharias Janssenovi
•
janssen
•První složený mikroskop zvětšoval 3x při zatažení tubusu a 9x při max. roztažení (měřil 1,2 m).
jansen_schema
•Holandský výrobce brýlí Hans Janssen se svým synem Zachariasem Janssenem údajně poprvé
zkonstruovali mikroskop složený z více čoček. O vynálezu existuje pouze záznam z pozdější doby
v dílech spisovatelů Pierre Borela (1620-1671) a Willema Boreela (1591-1668).
•1590

Okolo vynálezu mikroskopu existuje mnoho nejasností, obvykle je ale připisován otci a synu  - 1590
Hans a  Zacharias Janssenovým, brýlaři z Middleburgu v Holandsku sestavili zvětšovací přístroj,
sestávající z trubice se dvěma čočkami na koncích. Byl to první známý složený mikroskop. O vynálezu
existuje pouze záznam z pozdější doby v dílech spisovatelů Pierre Borela (1620-1671) a Willema
Boreela (1591-1668).
1609 Galileo Galiei (1564-1642) zkonstruoval první mikroskop složený ze spojky a rozptylky, nazval
ho occhiolino.
Ačkoli mikroskop měl pak několik dalších zlepšovatelů a propagátorů, učenci vytrvale desítky let ke
svému bádání používali obyčejnou lupu.

•Galileo Galilei (1564-1642) zkonstruoval první mikroskop složený ze spojky a rozptylky, nazval ho
occhiolino.
•1609
Galileo Galilei, Italian astronomer

•Cornelius Drebbel (1572-1633) předvedl v Londýně mikroskop založený na dvou spojných čočkách.
Nákres   mikroskopu se zachoval  na zadní straně Drebbelova dopisu králi Jamesovi I.
drebbel
•1619

•Řecky Micron = malý a scopos = cíl
•Giovanni Faber z Bambergu (1574 -1629) používá poprvé slovo mikroskop odvozené od slova teleskop.
•1625

•Robert Hooke
•- složený mikroskop
hook
•1665
•
•Micrographia
•- sledování tenkých řezů korkem - pojem BUŇKA

Toto je složený mikroskop Roberta Hooka.
Vynález složeného mikroskop přispěl k obrovskému rozvoji vědy. Právě  Angličan Robert Hook pomocí
svého složeného mikroskopu, u kterého k osvětlení objektu použil olejovou lampu a tzv. ševcovskou
kouli objevil,  že živé organismy jsou složeny z buněk – tento termín použit poprvé.
Ševcovská koule je naplněná buď vodou nebo lépe roztokem síranu měďnatoamonného, který pohlcuje
žluté paprsky a propouští paprsky bílé.

•Antony van Leeuwenhoek
•(1632 - 1723)
•Jednoduchý mikroskop (1660, 1674)
•Konvexní skleněná čočka byla připevněna do kovového držáku a byla zaostřována pomocí šroubu.
•čočka
•zaostřovací šroub
•držák vzorku

V 60. letech 17. století holandský obchodník s plátnem z Deft v Holandsku, Antony van Leeuwenhoek,
zhotovil a používal jednoduchý mikroskop. Vybrousil malou skleněnou kouli jako čočku se zvětšením
až 270x a použil ji pro práci s prvním jednoduchým mikroskopem.
Mikroskop vůbec neznal a musel jej sám objevit. Jako mladík prý jednou našem mezi haraburdím svého
otce (vetešníka) skleněný střípek. Než jej vyhodil, položil ho náhodou na kousek látky. Kdyby šlo o
dokonale rovný střep, nic moc by se nestalo. Kvůli nedokonalé výrobě byla však skla vždy více či
méně zvlněná. Leeuwenhoek si všiml, že struktura tkaniva vypadá pod střepem docela jinak než při
pozorování pouhým okem. Samozřejmě studoval kvalitu zboží, ale třeba také plísně na mase, vlastní
krev nebo sperma. Jako první člověk na světě objevil existenci mikroorganismů. Své objevy začal
popisovat a posílat Královské společnosti v Londýně. Učenci mu ale nevěřili. Když jim ale jejich
kolega Robert Hooke přinesl svůj mikroskop a oni uviděli totéž, co popisoval Leeuwenhoek, uvěřili
mu. Z pláteníka se stal zahraniční člen Královské společnosti a světoznámá osobnost. Zarputile však
odmítal opustit rodnou hroudu a už vůbec nehodlal některý ze svých mikroskopů dát z ruky. A tak se
podívat do "zázračných" přístrojů přišli k němu domů i ruský car a anglická královna. Když
Leeuwenhoek roku 1723 v 91 letech zemřel, zbylo po něm 419 mikroskopů, z nichž některé zvětšovaly
až 270krát.
Leeuwenhoekovy přístroje byly nesmírně jednoduché, přesto ve své době neměly konkurenci. Dnešní
mikroskopy nepřipomínaly ani v nejmenším. Jejich optickou část tvořila jediná čočka zasazená do
mosazné destičky, vzorek se umisťoval na hrot před čočku a jeho pozice se dala nastavit dvojicí
šroubů. Mikroskop se držel v ruce těsně u oka. Zatímco složitější přístroje ostatních konstruktérů
dosahovaly s bídou padesátinásobného zvětšení, Leeuwenhoekovy mikroskopy zvětšovaly až 270x a
jejich rozlišení bylo až 1,35 mm (tisícin milimetru). Právě to jejich tvůrci umožnilo spatřit do té
doby neviděné. Zkoumal snad vše, co bylo možno umístit pod mikroskop - hmyz, krev, zubní povlak,
jezerní vodu... Pozoroval bakterie, prvoky, spermie, krvinky, mikroskopické hlísty, vířníky. Tok
krve v kapilárách úhoře dokonce roku 1698 osobně demonstroval ruskému carovi Petru Velikému.

•Mikroskopy 17. století
•
slidingrod depovilly
•
•

1.Jednoduchý tyčovitý mikroskop, stal se základním tvarem použitým u ostatních jednoduchých
mikroskopů po několik století.
2. mikroskop ze slonoviny, stříbro, Itálie
3. Jednoduchý Italský mikroskop ze dřeva lignum vitae, objekty byly
    připevněny na dřevěném disku nad kterým byla čočka
4. Tento elegantní mikroskop měl dva ryté destičky, které jsou výklopné na jedné straně a připojené
na rukojeť ze slonoviny. Je vyryto "Depovilly a Paris", byl vyroben kolem roku r 1686.
5. Tripodický mikroskop ze dřeva - lignum vitae (Guaiacum),
   lepenky  a kůže vykládané zlatem
 6. horizontální mikroskop – optická osa vodorovná, osvětlení
Bonanni navrhl důmyslné ozubené kolečko pro  jemné zaostření, velmi pokročilé  pro toto časové
období. Bonanni z mikroskopu měl také mnoho dalších pokročilých funkcí, jako kondenzor z dvojité
čočky před osvětlením.
lignum vitae, je jeden ze společných názvů pro dřeva stromů z rodů Guaiacum, Bulnesia aj.,
rostoucích kromě Jižní Ameriky také v Indii. Jde o jedny z nejtvrdších, nejhustších a nejtěžších
dřev na světě - jejich objemová hmotnost ve vysušeném stavu se pohybuje většinou mezi 1100 až 1300
kg/m3. Některá dřeva (např. Guaiacum sanctum a G. sermientos) jsou zelenavě hnědá se žlutohnědým
žilkováním a nepravidelnou kresbou, jiná (G. guatemalense) černohnědá se žlutým žíháním, další (G.
officinale) až zelenočená. Vesměs jsou extrémně tvrdá a těžká, využívaná nejčastěji v lodním
stavitelství a k výrobě strojních součástí.

•Mikroskopy 18. století

Kostěný bezejmenný „bleší“ mikroskop - stále přetrvávají jednoduché mikroskopy(kolem 1700)
Culpeperův mikroskop (Anglie)- složený, trojnožky z mosazi, dvě zrcátka, dřevo, chráněn měkkou kůží
(1730)
Na požádání krále Jiřího III zhotovil Georg Adams stříbrný mikroskop s ornamenty

•Mikroskopy 19. století
thomaswinterexhibition wsjonesbotanical1800s


•Mikroskopy 20.století
bandlfluorescence1929 bandlstereozoom4


•Světelný mikroskop - základní pracovní nástroj
•Účel mikroskopu:
• zvětšení
• rozlišení detailů
• kontrast
fazovy kontrast
•Olympus BX 50: Fázový kontrast
DIC
•Olympus BX 50: Nomarského kontrast
Macrogyrodactylus-opistJPG
•Olympus BX 50: procházející světlo

•Jednoduchý mikroskop
•jedna čočka nebo jeden systém čoček (lupa)
•Složený mikroskop
•více systémů čoček
http://files.mtbushcraft.webnode.cz/200000022-08d0209ca5/lupa.jpg
http://www.arsenal.cz/files/uploaded/UserFiles/Image/mikroskopy/.%5b800-600%5d.1191%20Osvald%200104
.jpg http://files.mikroskop-mikroskopy.cz/200000061-63a0d64994/B1-220ASC.jpg
https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTsFSHJ650xug-wQuRpFeLaRZKQFxxj_JFsRdYZ-c0noci
pPWxp

•
SZ2(2)
•Jaký je rozdíl mezi binokulárním mikroskopem a stereomikroskopem?
•Stereomikroskop má dvě samostatné optické dráhy – pro pravé a levé oko zvlášť. Toto uspořádání
poskytuje prostorové vidění, trojrozměrný pohled a přímý obraz. Čím je větší úhel φ tím je
výraznější stereovjem
schéma mikroskopu

ČÁST MECHANICKÁ:
stativ, tubus, revolverový
měnič objektivů, stolek,
makrošroub, mikrošroub,
vypínač, ovládání intenzity
světla
ČÁST OSVĚTLOVACÍ:
zdroj světla, zrcátko, polní clona, kondenzor,
aperturní clona
ČÁST OPTICKÁ:
objektivy, okuláry
•Složení mikroskopu CX 31

•Část mechanická
•Stativ - tvoří pevnou dolní část mikroskopu. Někdy se ještě rozlišuje na nohu a pevné rameno
(zejména u starších typů mikroskopů). Do stativu je zabudováno u moderních mikroskopů osvětlení, u
starších typů se prosvětlení preparátu provádělo pomocí zrcátka, které odráželo denní světlo nebo
světlo z nezávislé lampy. •Stolek - je u běžných mikroskopů tzv. křížový, což znamená, že umožňuje
pohyb preparátu v pravoúhlém systému souřadnic, takže je možné si zaznamenat polohu nalezeného
objektu a později se k němu vrátit. Pohyb stolku je ovládán dvěma šrouby, jedním pro pohyb podle
x-ové souřadnice, druhý pro y-ovou souřadnici. Podložní sklo s preparátem se vkládá do držáku
neboli vodiče preparátu a je přidržováno ramínkem s pružinou.
•
C:\Users\Majka\Documents\majka dokumenty\majka vsetky
dokumenty\ucitel\zoologicka_mikrotechnika_2010\miktech\stage1.jpg

•Revolverový měnič objektivů - umožňuje plynulou výměnu jednotlivých objektivů při zachování
optické osy a hrubého zaostření bez pohybu stolku (tj. zachovává nalezenou pozici na preparátu)
•Tubus - trubice spojující objektiv s okulárem, která zabraňuje vstupu rušivého světla z okolí. U
moderních mikroskopů jsou uvnitř tubusu hranoly rozdělující světelný paprsek přicházející z
objektivu do dvou svazků, nasměrovaných do dvou okulárů (binokulární mikroskop), případně se
odděluje část paprsků pro snímání obrazu kamerou (trinokulární uspořádání). Binokulární nástavec
umožňuje nastavení vzdálenosti okulárů dle vzdálenosti očí pozorovatele a nezávislé zaostření
obrazu v každém okuláru (viz dále okuláry). • Mechanická (optická) délka tubusu - vzdálenost mezi
horním a dolním koncem tubusu, mění se vzájemným posunem dvou na sebe nasunutých částí, • 1. dána
výrobcem (160 - 170 mm) a je nutno ji dodržovat - objektivy a okuláry konstrukčně přizpůsobeny •
2.  nekonečná délka tubusu (vkládání modulů), ¥, objektivy s korekcí na nekonečno (soustava čoček)
•Zaostřovací šrouby (makro- na hrubé ostření a mikro- na jemné doostření), které ovládají svislý
pohyb rampy, na kterou je připojen jednak vlastní stolek, na nějž se umisťuje preparát, jednak
nosič kondenzoru.
•Vypínač, ovládání intenzity světla
•Část mechanická

ČÁST  OSVĚTLOVACÍ
•Pozorování ve světle procházejícím x  dopadajícím
•
•Zdroj světla - lampa v noze stativu s kolektorovou čočkou (fixně seřízená), kolektor spolu se
zrcátkem soustřeďuje světlo do kondenzoru •        V dnešní době se  pro běžnou světelnou
mikroskopii používají nejčastěji wolfram-halogenové  lampy, které se umisťují do osvětlovací
komůrky zabudované do spodní části stativu. Při výměně lampy je třeba dodržovat dvě zásady:
1.zahřátou lampu nechat vždy dostatečně vychladnout (20 min.), protože se při práci zahřívá na
velmi vysokou teplotu 2.nikdy nesahat na sklo lampy, protože otisky prstů se vpálí během používání
do skla a zkracují životnost lampy; při výměně proto držíme novou lampu přes vnější obal. •Proud
světla vycházející z lampy bývá usměrněn sběrnou čočkou do  světelného kanálu ukončeného polní
clonou, která vymezuje maximální velikost osvětleného pole (používá se při malém zvětšení, viz
práce s mikroskopem). Mezi sběrnou čočku a polní clonu se mohou umisťovat speciální filtry (pro
vyvážení barev, pro specifickou absorpci určité barvy) zlepšující kontrast.
•
•
•

C:\Users\Majka\Documents\majka dokumenty\majka vsetky
dokumenty\ucitel\zoologicka_mikrotechnika_2010\miktech\bh2cutaway.jpg
ČÁST  OSVĚTLOVACÍ

•Kondenzor - soustřeďuje světlo ze světelného zdroje do kužele, který
• 1. rovnoměrně osvětluje preparát
• 2. odpovídá numerické apertuře objektivu
•Při změně objektivu je vhodné upravit N.A. kondenzoru aperturní clonou
•N.A. kondenzoru = 80% N.A. objektivu
•Aperturní clona (kondenzorová, irisová) - umístěna před vlastní soustavu kondenzorových čoček a
vymezuje šířku proudu světla, který prochází kondenzorovými čočkami. •      - reguluje množství
světla přicházejícího do mikroskopu, stupnice, podle které se nastavuje numerická apertura
kondenzoru
•Typy kondenzorů
•Abbeův -  nejjednodušší, N.A. = 1,25
•   - není korigován chromaticky ani sféricky,  vhodný pro jednoduché objektivy
•Aplanatický – korekce sférické vady
•Achromatický – korekce chromatické vady
•Aplanaticko-apochromatický – korigován pro obě vady
ČÁST  OSVĚTLOVACÍ

•Chromatická vada
•
•-souvisí s tím, že ohnisková vzdálenost čočky závisí na indexu lomu a ten se mění podle barvy
použitého světla (tedy podle vlnové délky). Bílé světlo je však složeno z různých vlnových délek a
každá jeho složka (tzn. každá barva) se při průchodu čočkou láme trochu jinak. Při průchodu čočkou
s barevnou vadou tedy dochází k rozkladu světla.
•V důsledku této vady je obrazem bodu bod určité barvy, který je obklopen mezikružím jiných barev.
•Chromatickou vadu lze alespoň částečně odstranit vhodnou kombinací spojných a rozptylných čoček
(achromatický doublet), což se nazývá achromatizací optické soustavy
magnify-clip
VADY OPTICKÉHO ZOBRAZOVÁNÍ
•http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/chromatic/index.html
•Vady čoček jsou způsobeny jednak vlastním materiálem čoček (vada sférická, astigmatická, koma,
vyklenutí zorného pole a distorze), jednak nehomogenním charakterem bílého světla (chromatická
vada).

•Sférická vada
•Její příčinou je odlišná ohnisková vzdálenost pro různě vzdálené paprsky od optické osy.
•Sférická (též kulová nebo otvorová) vada vzniká tehdy, pokud na čočku dopadá široký svazek paprsků
rovnoběžných s osou, přičemž paraxiální paprsky se za čočkou setkávají v jiném bodě než okrajové
paprsky širokého svazku. (Jako paraxiální paprsky označujeme paprsky v blízkosti optické osy
přístroje, které s touto osou svírají jen malý úhel, jsou s ní tedy téměř rovnoběžné)
•Tato vada způsobuje, že obrazem bodu není bod, ale rozmazaná kruhová ploška.
•Tuto vadu lze také částečně kompenzovat kombinací čoček.
•http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/spherical/index.html
VADY OPTICKÉHO ZOBRAZOVÁNÍ

•Vyklenutí (rovinnost) zorného pole
•Vada souvisí s tím, že body ležící v rovině rovnoběžné s ohniskovou rovinou nevytvoří ostrý obraz
na rovinu snímače, ale na zakřivenou plochu, a to vypuklou nebo vydutou. Obraz roviny kolmé k
optické ose se tak zobrazí na zakřivené ploše, čímž dochází k rozmazání a neostrosti. Znamená to,
že můžeme zaostřit buď na kraj nebo na střed pole.
•http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/curvatureoffield/index.html
VADY OPTICKÉHO ZOBRAZOVÁNÍ

 ČÁST  OPTICKÁ
•Značení objektivů
•Vytváří zvětšený převrácený a skutečný obraz předmětu
•Čím je kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím je větší zvětšení
•
•Objektivy - Nejdůležitější optická součást mikroskopu
•

•0.5 ×
•1- 1.25 ×
•2 – 2,5 x Typy imerze
•4 ×, 5 × (proužek blíže k preparátu)
•10 ×
•20 × Olej
•40 ×, 50 × Voda
•                                                                     Glycerol
•60 ×
•100 ×
•150 ×, 250 ×
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•Zvětšení objektivů
•
 ČÁST  OPTICKÁ

•Achromáty - korigovánu chromatickou vadu pro dvě vlnové délky (červené a modré světlo) a sférickou
vadu pro zelené světlo. Nejlepších výsledků dosahují při použití zeleného filtru a černobílých
filmů pro mikrofotografii.
•Fluority (semi-apochromáty)
•        - chromaticky pro modré, zelené a červené světlo
•            - sférická vada pro modré a zelené světlo
•        - vhodné pro barevné zobrazení
•jejich název vychází z historického postupu výroby - dělaly se z kazivcového (fluoritového) skla.
Nyní již tomu tak není, ale protože jsou objektivy určeny hlavně pro fluorescenční aplikace
(vynikající optické vlastnosti, dobře propouští UV záření), a jejich název fluorescenci evokuje,
není důvod jej měnit. Jsou vhodné i pro pozorování ve světlém poli.
•Apochromáty - chromaticky pro krátkovlnné modré,              zelené a červené světlo
•- sférická vada pro krátkovlnné modré a zelené světlo
•            - nejvyšší kvalita barevného zobrazení
•Plan- korigováno vyklenutí zorného pole
•Korekce objektivů
 ČÁST  OPTICKÁ

•Typy objektivů
•Objektiv by měl poskytovat co nejkvalitnější zobrazení
•Kvalita objektivu je určena stupněm korekce optických aberací a rovinností obrazového pole
•Plan-
•
•
•Ach
•Apo
•Fl
•
•
•
•
•
 ČÁST  OPTICKÁ

Korekce vady zklenutí zorného pole - PLAN
•Důležitá zejména pro záznam obrazu
•Rozdíl mezi Ach a Plan Ach
 ČÁST  OPTICKÁ

•Pracovní vzdálenost: Vzdálenost mezi preparátem a
•nejnižším bodem objektivu (větší zvětšení – menší PV)
•Rozlišovací schopnost: Schopnost rozlišit dva body, tzn. že vyjadřuje minimální vzdálenost dvou
objektů tak, aby byly vnímány jako dva jednotlivé objekty
•Hloubka ostrosti: Hloubka obrazu, v níž bude zaostřený obraz rovnoměrně ostrý. Hloubka ostrosti se
zvětšuje se zavíráním aperturní clony. S rostoucí numerickou aperturou objektivu hloubka ostrosti
klesá
•Číslo pole: Průměr zorného pole  okuláru (v mm)
•Průměr zorného pole: Skutečný průměr pozorovaného pole v mikroskopu (v milimetrech)
•Celkové zvětšení: Součin zvětšení objektivu a zvětšení okuláru
•Numerická apertura: Numerická apertura je číselná hodnota. S rostoucí numerickou aperturou roste i
rozlišovací schopnost objektivu
•Další charakteristiky objektivu
 ČÁST  OPTICKÁ
Pracovní vzdálenost

Numerická apertura objektivu
•Numerická apertura (N.A.) = n × sina
•N.A. ≥ 1 nelze dosáhnout bez imerze
•Se zvětšením roste numerická apertura objektivu
•http://www.olympusmicro.com/primer/java/nuaperture/index.html
 ČÁST  OPTICKÁ

•Objektivy pro práci bez krycího skla - NCG (no cover glass)-hematologie
•Objektivy s dlouhou nebo ultradlouhou pracovní vzdáleností
•Objektivy s korekcí na tloušťku krycího skla - korekční prstenec
•
•Objektivy s irisovou clonou - omezení světelného toku objektivem, vliv na hloubku ostrosti
•Odpružené objektivy - zamezení mechanickému doteku čočky
•Objektivy pro speciální pracovní postupy - např. fázový kontrast, DIC
•
•Suché objektivy   - mezi objektivem a krycím sklem je vzduch
•
•
•Imerzní objektivy - imerzní olej (mezi objektiv a krycí sklo, mezi přední čočku kondenzoru a
podložní sklo)
•
•http://www.olympusmicro.com/primer/java/aberrations/slipcorrection2/index.html
 ČÁST  OPTICKÁ

•Homogenní imerzní systém
•
•
•Význam použití imerze
•
tableblcorner
•
•
•
•Frontální čočka kondenzoru
•
•Imerzní olej
•
•objekt
•
•
•
•Krycí sklo
•
•Imerzní olej
•
•Frontální čočka objektivu
•
•
•Uzavírací médium
•Imerzní média      index lomu
materiál
Index lomu
vzduch
1,0003
voda
1,333
glycerin
1,4695
Parafinový olej
1,480
Cedrový olej
1,515
Syntetický olej
1,515
anisol
1,5178
bromonaftalen
1,6585
metylenjodid
1,740
•

Rozlišovací schopnost čoček objektivu závisí na jeho numerické apertuře, která je závislá na indexu
lomu média mezi vzorkem a objektivem. Větší index lomu znamená, že čočky mohou pojmout více světla
a vytvořit tak jasnější obraz. Vzduch má relativně nízký index lomu a pokud je tím prostředím mezi
vzorkem a objektivem, snižuje numerickou aperturu objektivu. Objektiv s větší numerickou aperturou
potřebuje větší index lomu a imerzní olej takový index lomu poskytuje. Pro optimální zobrazení je
třeba také dát olej na čočku kondenzoru. Imerzní objektivy se označují jako „oil“ nebo „oel“.
Objektivy označené „wi“ vyžadují vodu jako imerzní kontaktní médium.

 ČÁST  OPTICKÁ
•Okulár
Pro optimalizaci výsledků je potřeba vybírat okuláry odpovídající použitým objektivům (jejich typu
a korekci vad).
Zvětšuje obraz vytvořený objektivem
Zvětšení okuláru je prázdné - nezobrazuje více detailů,
 než bylo zobrazeno objektivem
Podle uspořádání čoček a pevné clony se okuláry dělí na:
 negativní (Huygensovy)
pozitivní (Ramsdenovy) - umožňuje snadnou montáž měřítka – pozor na prach
C:\Users\Majka\Documents\majka dokumenty\majka vsetky
dokumenty\ucitel\zoologicka_mikrotechnika_2010\miktech\huyram.jpg

•Typy okulárů
•Huygensův okulár H - skládá se ze 2 čoček, v kombinaci se slabými objektivy (achromáty)
•Ortoskopické okuláry O - nezkreslují zorné pole, v kombinaci s objektivy achromatickými a
planachromatickými •Kompenzační okuláry K - kompenzují chromatickou vadu objektivů, jsou určeny pro
práci s apochromáty •Periplanatické okuláry P - kompenzují chromatické vady a částečně i vyklenutí
zorného pole, v kombinaci s planachromatickými objektivy
•
•Průměr zorného pole (FN - field number) - 18 - 22 mm,
•     širokoúhlé okuláry  (UW) - až 25 mm
•Projektivy - okulár používaný při mikrofotografii
•Brill okuláry - umožňují pozorování a kompenzaci pro dioptrické oko, dioptrická korekce, manžety
•
 ČÁST  OPTICKÁ
•Okulár

•
•Maximální užitečné zvětšení mikroskopu je však určeno i rozlišovací schopností objektivu. Za
podmínek, kdy je minimální vzdálenost dvou rozlišitelných bodů srovnatelná s rozlišovací schopností
lidského oka, obraz se nezlepší ani při použití silně zvětšujících okulárů, kdy dostaneme jen
rozměrnější obraz bez nových detailů.
•Zvětšení mikroskopu
•Zvětšení obrazu mikroskopem je dáno zvětšením okulárů a zvětšením objektivu.
Užitečné zvětšení mikroskopu:
-Minimální – numerická apertura objektivu x 500
-Maximální – numerická apertura objektivu x 1000

Užitečné zvětšení mikroskopu
•Celkové zvětšení ≤ 1000 × N.A. objektivu
•Příklad 1:
•    Objektiv 40 ×, N.A. = 0,65
•    Okuláry 15 × 40 × 15 = 600 ≤ 650 O.K.
•Příklad 2:
•    Objektiv 100 ×, N.A. = 1,3
•    Okuláry 15 × 100 × 15 = 1500 > 1300       ×
•    Okuláry 12,5 × 100 × 12,5 = 1250 ≤ 1300  O.K.
•Pozor na další zvětšení při přenosu digitálního obrazu na monitor!
•prázdné zvětšení !!!

•Měření mikroskopických objektů
•v horizontální rovině, kolmé na optickou osu, se provádí pomocí okulárového a objektivového
mikrometru
•Okulárový mikrometr je skleněná destička, opatřená měřící stupnicí. Mikrometrická stupnice se
umisťuje do roviny polní clony okuláru, tj. do přední ohniskové roviny očnice okuláru, takže se
nezobrazuje celým mikroskopem, ale jen okulárem.Neměří se jím tedy vlastní objekt, ale jeho obraz,
respektive meziobraz, vytvořený v rovině clony. Aby se z velikosti obrazu, vyjádřené určitým počtem
dílků okulárového mikrometru, odvodila skutečná velikost měřeného objektu, musí se dotyčný počet
dílků mikrometru znásobit mikrometrickou hodnotou. Tato hodnota, závislá na zvětšení a mechanické
tubusové délce, se získává vzájemným pozorováním stupnic okulárového a objektivového mikrometru.

•Mikrometrobjektiv je destička formátu podložního skla, opatřená mikrometrickou stupnicí, kde 1 mm
je rozdělený na 100 dílků, 1 dílek = 0,01 mm = 10 mikronů. Stupnice je chráněna krycím sklem.
Objektivový slouží jako délkový standard pro cejchování stupnice okulárového mikrometru a k určení
zvětšení mikroskopu, nebo k určení měřítka zobrazení objektu mikrofotografií nebo kresbou.
•
•měřící okulár
•
•měřítko
•
•
•
•
•mikrometrobjektiv
•
•

•Postup při měření délky, šířky či průměru mikroskopických objektů
•1. kalibrace: místo obyčejného okuláru vložíme okulár s mikrometrem a místo preparátu objektivový
mikrometr (1 mm je na něm rozdělen na 100 dílků, takže jeden dílek odpovídá 10 μm). Při použití
určitého objektivu srovnáme obrazy obou mikrometrů tak, že se jejich stupnice kryjí a odečteme,
kolika dílkům objektivového mikrometru odpovídá kolik dílků okulárového mikrometru. Vypočítáme tzv.
•mikrometrický koeficient pro daný objektiv (tj. kolika mikrometrům odpovídá jeden dílek
okulárového mikrometru při použití daného objektivu) vypočítáme jako
•(a : b) . 10 [μm]
•
•
•10 dílků měřícího okuláru
• = 75 dílkům mikrometrobjektivu
•tj. (750 µm)
•1 dílek MO = 75 µm
•Průměr cévy na preparátu = 70 dílků MO = 70 x 75 µm
•
•

•Postup práce s mikroskopem
•Mikroskop přenášíme oběma rukama (kapotáž) !!!
•Manipulujeme pouze pomocí vroubkovaných částí !!!
•
•1. Zapneme mikroskop, vložíme preparát, zařadíme objektiv 10x nastavíme osvětlení, zaostříme na
preparát.
•
•2. Nastavíme vzdálenost okulárů a provedeme dioptrickou korekci (okulár bez dioptru zaostříme na
objekt mikrošroubem, zavřeme oko; okulár s dioptrem doostříme podle svého oka).
• Použití manžet: při pozorování s brýlemi ponechte manžety ohrnuté, nikdy manžety neodstraňovat z
hygienických důvodů !!!
•
•3. Nastavíme aperturní clonu kondenzoru.
•
•4. Při použití jiného  objektivu doostříme mikrošroubem a nastavíme
•    odpovídající aperturní clonu.
•
•5. Zařadíme filtr, přizpůsobíme osvětlení a pozorujeme.
•

•Köhlerovo osvětlení
•nastavujeme do optimální polohy:
• clonu osvětlovacího systému
• clonu kondenzoru
• polohu kondenzoru
•1. Umístíme preparát a zaostříme s objektivem 10x
•2. Uzavřeme polní clonu
•3. Kondenzor snižujeme nebo zvyšujeme tak dlouho, až je obraz
svítícího pole ostře ohraničený
•4. Polní clonu otevřeme tak, aby se dotýkala okrajů zorného pole.
•5. Obraz svítícího pole posuneme centrovacími šrouby       kondenzoru do středu zorného pole
•http://www.olympusmicro.com/primer/java/microscopy/kohler/index.html
•
•Výsledkem Köhlerova nastaveni je rovnoměrné a maximální osvětlení preparátu, ležícího v předmětové
rovině. Současně by měla být dosažena nejlepší kombinace mezi rozlišovací schopností a kontrastem.

August Köhler (1866-1948)

•Potřeby pro mikroskopování
•Krycí skla  -různá tloušťka (0,08; 0,11; 0,13;0,17;0,20 mm)
• - velikost (mm) a tvar
•Podložní skla - různá tloušťka (1; 1,2 mm) velikost (26 x 70 mm)
• - zabroušené hrany, matované
•Preparační soustavy - pinzeta, skalpel, nůžky, preparační jehly, štětec, pipeta
•Laboratorní sklo - Petriho miska, hodinové sklo, kádinka atd.
•Krabice na preparáty
•Slohy na preparáty
•

•
•KVALITA ZOBRAZENÍ BIOLOGICKÝCH OBJEKTŮ ZÁVISÍ NA
•
•1. dostatečném zvětšení obrazu (pozor na maximální užitečné zvětšení  =  numerická apertura
objektivu x 1000)
•2. rozlišovací schopnosti mikroskopu  (závisí na numerické apertuře objektivu a kondenzoru  a
kvalitě osvětlení preparátu , tj. optimálním nastavení Koehlerova osvětlení)
•3. kontrastu obrazu, který lze efektivně zvýšit pomocí        a) cytologických a histologických
barviv                         b) optických metod, které převádějí rozdíly v indexu lomu různě
tlustých částí objektů na jasový kontrast obrazu
•
•

•                                  Kontrastní metody
•Slouží k zvýšení kontrastu obrazu tak, aby byl dobře pozorovatelný.
•
•Nejpoužívanější metody:
•  Temné pole
•  Fázový kontrast
•  Polarizované světlo
•  Reliéfní kontrast
•  Diferenciální interferenční kontrast
•  Fluorescence

•Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno přístupné. Naopak praktické používání fázového
kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou žádné potíže. Stručně můžeme říci, že lidské oko
je schopno vnímat rozdíly v amplitudě světelného vlnění jako rozdílnou intenzitu světla a rozdíly
ve vlnové délce jako různou barvu světla. Nezbarvené (průhledné) objekty jsou pro světlo téměř
všude stejně prostupné, ale protože jejich různé části mají různou optickou hustotu, lomí světlo
každá z nich pod jiným úhlem. V důsledku toho se světelné paprsky vystupující z preparátu liší fází
svého vlnění, amplituda zůstává nezměněna. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem,
není zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily, lišící se kontrastem, je pro lidský zrak
průhledný, čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně
identifikujeme. Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu, nám umožňuje pozorovat i
takové objekty, které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou
součástí fyzikální optiky.
•
•
• Metoda fázového kontrastu
•amplituda - intenzita světla
•vlnová délka - barva
•fázový posun - neviditelný pro lidské oko
Kopie - spectrum
•vlnová délka λ
• λ/4
•!!Metoda převádí rozdíly fází na rozdíly intenzit.

•Fázový kontrast
•Na kondenzor se umístí maska s kruhovou štěrbinou, kterou proniká světlo do objektu. V objektivu,
v místě obrazu kondenzorové masky, je umístěna fázová maska. V místě šterbiny u kondenzorové masky
je u masky fázové napařená polopropustná vrstva kovu, která mění fázi světla o čtvrtinu vlnové
délky. Díky tomuto uspořádání prochází nedifraktované (neohnuté) záření ze zdroje  (štěrbiny
kondenzorové masky) tou částí fázové masky, která mění fázi světla. Ostatní vlnění, které se na
objektu ohnulo a nebo zlomilo, projde beze změny. Při interferenci vln v obrazové rovině se části
objektu, které různým způsobem mění fázi světla projeví různou intenzitou světla. Tato technika
tedy převádí rozdíly v posunu fáze světla procházejícího různými částmi objektu, které nevidíme, na
rozdíly v intenzitě světla, kterou můžeme pozorovat.

Frits Zernike, Dutch physicist
•Frits Zernike, 1934 - Nobelova cena
•Fázový kontrast

•            Metoda fázového kontrastu
•Frits Zernike, 1934 - Nobelova cena
•Karl Zeiss, Jena
•ZAŘÍZENÍ PRO FÁZOVÝ KONTRAST
•změna fáze vlnění na  změnu amplitudy
•=
•viditelné pro člověka
fazovy kontrast
•Průvodní jev fázového kontrastu:
•„aureola“ (haló efekt) –světlý obrys
•kolem objektu

Fyzikální principy fázového kontrastu nejsou snadno přístupné. Naopak praktické používání fázového
kontrastu ve světlené mikroskopii nečiní většinou žádné potíže. Stručně můžeme říci, že lidské oko
je schopno vnímat rozdíly v amplitudě světelného vlnění jako rozdílnou intenzitu světla a rozdíly
ve vlnové délce jako různou barvu světla. Nezbarvené (průhledné) objekty jsou pro světlo téměř
všude stejně prostupné, ale protože jejich různé části mají různou optickou hustotu, lomí světlo
každá z nich pod jiným úhlem. V důsledku toho se světelné paprsky vystupující z preparátu liší fází
svého vlnění, amplituda zůstává nezměněna. Změna fáze světla, která nastává při průchodu objektem,
není zrakem přímo viditelná. Nemá-li tedy objekt detaily, lišící se kontrastem, je pro lidský zrak
průhledný, čirý. U řady biologických objektů tyto vlastnosti převažují a proto je zrakem obtížně
identifikujeme. Mikroskop, vybavený pro pozorování ve fázovém kontrastu, nám umožňuje pozorovat i
takové objekty, které způsobují jen fázový posun světla. Hlubší poznatky o tomto principu jsou
součástí fyzikální optiky.

•Objektivy pro fázový kontrast - fázová destička (převádí neviditelné fázové rozdíly na   rozdíly
amplitudové)
•Kondenzor - aperturní kroužek pro různé zvětšení
•Centrovací dalekohled - seřízení fázových prstenců
•Zelený filtr- 540 nm
fázový objektiv
•fázová destička (difrakční ploška)
•objekt
•kondenzor
•objektiv
•Kondenzorová maska (štěrbinová apertura)

Mikroskop pro pozorování ve fázovém kontrastu musí být pro tuto metodu vybaven. Potřebujeme
objektivy pro fázový kontrast a kondenzor pro fázový kontrast. Oba tyto optické díly jsou opatřeny
tak zvanými fázovými prstenci. U objektivů jsou jejich trvalou částí, u kondenzoru jsou používány
podle potřeby. Objektivy pro fázový kontrast mají na jedné ze svých čoček nanesený neprůhledný
"fázový" prstenec, na kterém nastává posun fáze světelné vlny. Objektivy pro fázový kontrast mohou
sloužit též pro pozorování bez fázového kontrastu, avšak prstenec v objektivu způsobuje v tomto
případě mírné snížení jakosti obrazu - udává se přibližně 10 %. U objektivu s malým zvětšením se
toto zhoršení prakticky neprojevuje.
Fázový kontrast je značně závislý na seřízení mikroskopu. K tomu se dodává účelná pomůcka, tzv.
středící (centrovací) dalekohled. Ten se nasadí místo jednoho okuláru a pak pozorujeme polohu
fázových prstenců, které můžeme vystředit pomocí nastavovacích prvků. Přesný postup je v návodu ke
každému mikroskopu, nicméně vyžaduje trochu zkušeností. Je běžné používat pro světlé pole a fázový
kontrast společné objektivy až do zvětšení 40x, pro vyšší zvětšení je téměř nutné používat pro
každou metodu jednoúčelový objektiv.
Kondenzor pro fázový kontrast bývá u jednoduchých mikroskopů vybaven tzv. šoupátkem, nesoucím 1
nebo 2 fázové prstence. Tyto fázové prstence jsou svým tvarem přizpůsobeny vždy objektivu s určitým
zvětšením. Dokonalejší mikroskopy jsou vybaveny univerzálním otočným kondenzorem, vybaveným třemi
fázovými prstenci, prstencem pro pozorování v tmavém poli a otvorem pro pozorování ve světlém poli.
Volba se provádí otáčením karuselu, nesoucím jednotlivé prstence. Pozorování při fázovém kontrastu
se podstatně zlepší, použijeme-li zelený interferenční filtr. Tento filtr propouští zelené světlo
vlnové délky kolem 540nm, které zvyšuje vjem kontrastů. Oko je na tuto vlnovou délku světla
maximálně citlivé.

phasealignmentfigure1
•http://www.microscopyu.com/tutorials/java/phasecontrast/microscopealignment/index.html
•Seřízení fázových destiček
•http://www.olympusmicro.com/primer/java/phasecontrast/phasemicroscope/index.html

buňky ve fázovém kontrastu
•procházející světlo x fázový kontrast


DIC
•vzniknou dva identické obrazy objektu, které jsou vůči sobě laterálně posunuty různá tloušťka
preparátu = fázové rozdíly
•Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
•- povrchová topologie objektu
•kolem 1950, Georges Nomarski
•mikroskop - 1959 Carl Zeiss
•polarizátor
•Wollastonův hranol
•kondenzor
•preparát
•objektiv
•
•Wollastonův hranol
•analyzátor
•lineární polarizace světla
•rozdělení polarizovaného světla na dvě složky
•interference dvou laterálně posunutých obrazů a srovnání fázových rozdílů v celé ploše obrazu
•zvětšený obraz vzorku se  jeví jako šikmo osvětlený trojrozměrný objekt







•pylové zrno borovice
•Ancylostoma duodenale
•Clonorchis sinensis
•červené krvinky
•řez ledvinou myši
•příchytné svorky diplozoona

heliozoapc heliozoadic spirulinadic spirulinapc
•Fázový kontrast
•DIC

•Nové technologie
•
• mikroskop s videokamerou
• spojení počítače s mikroskopem
• digitalizace a analýza obrazu
•DIGITÁLNÍ MIKROSKOP Olympus MIC-D
Místo klasického pozorování pomocí okulárů zobrazuje MIC-D na monitoru osobního počítače, který je
s mikroskopem spojen USB kabelem. Protože se jedná o digitální obraz, jeho zpracování je velmi
rychlé a snadné: uživatel jej může uložit, vymazat, upravit, vytisknout, umístit na web nebo poslat
e-mailem.

•Čočka z kapky vody
•Model na základě Leeuwenhoekova mikroskopu si můžete snadno sestrojit. Jeden z nejjednodušších se
dá vyrobit jen pomocí kancelářské svorky. Kleštěmi nejdřív svorku narovnejte (na to je lepší použít
kleště s plochými čelistmi). Jeden konec zahněte do smyčky. Ta by měla mít průměr asi 1,5 mm a být
co nejkulatější. Snažte se přitom moc nepoškrábat kov, ze kterého je smyčka vyrobena. Potom potřete
smyčku trochou oleje nebo sádla, aby dostala jemný povlak. Ponořte ji do vody (nejlépe destilované)
a pak ji pomalu vytáhněte ven. Kapka vody, která se na ní uchytí, bude fungovat jako čočka. Není
tak silná jako čočky z Leeuwenhoekova mikroskopu, ale má stejný sférický tvar a bude zvětšovat 2x
nebo i vícekrát.
•
•Malý mikroskop
•Můžete si vyrobit i malý mikroskop, který se hodí na pozorování drobných vzorků. Ustřihněte
plechový pásek o velikosti 10 cm * 2,5 cm například z nějaké plechovky od jídla. Pokud jsou hrany
ostré, zapilujte je. V kovovém pásku vyvrtejte uprostřed dírku o průměru 2,5 mm. Ať uděláte tuto
dírku jakýmkoli způsobem, snažte se, aby byla co nejkulatější a byla bez otřepů. Pro očištění je
dobré okolí dírky přeleštit smirkovým papírem. Potom odfoukněte případný prach, který tam zůstal.
•
•Ohněte konce kovového pásku dolů, aby jste ho mohli postavit (jako stoleček). Na pásek dejte,
stejně jako v předcházejícím případě, olej nebo sádlo a tužkou pak přeneste na tuto dírku kapku
vody tak, aby v ní zůstala. Na nějaké podložky (například plechovky) položte kus skla, jak je to
ukázáno na obrázku. Opatrně pak pásek postavte do středu skla a dávejte pozor, ať nevylijete
"čočku". Pod sklem podepřete malé zrcátko tak, aby se světlo z něho odráželo nahoru skrz čočku.
Cokoli, co chcete prozkoumat (pyl, malý hmyz, zrnko soli nebo písku atd.), pak dejte pod čočku.
Zaostřujte jemným zatlačením na plíšek.
•
•Zdroj: FyzWeb
•Vyrobte si „mikroskop“

IMG_0030.jpg
•Kreslící zařízení
•Studené světlo