•Příprava mikroskopických preparátů • zhotovení - objekt uzavřeme do vhodného média a prohlížíme mezi sklem podložním a krycím • uzavírací médium - tekuté nebo tuhnoucí • X - mikroskopické preparáty bez média (vzduch) • • • •Podložní sklo •uzavírací médium •krycí sklo •objekt • Nativní preparát, vitální barvení http://www.zbynekmlcoch.cz/informace/images/stories/texty/blechy_blecha_preziti_anatomie_vlastnosti _deratizace_likvidace.jpg •Nativní preparáty, vitální barvení • •Podle trvanlivosti: • • •Druhy preparátů Trvalé – fixovaný materiál • http://jenningsanimalwiki2011.wikispaces.com/file/view/ouiou.jpg/203056930/ouiou.jpg • Dočasné - nativní, čerstvé •Druhy preparátů •Druhy preparátů •Podle způsoby přípravy: •totální (celé objekty) • •Médium: •kanadský balzám •Parazit (objekt): •Ctenocephalides felis • •Hostitel: •Felis silvestris f. catus • • • •Parazit (objekt): •Dicrocoelium dendriticum • •Hostitel: •Ovis ammon f. aries • • •Barvení: železitý acetokarmín • •Médium: •kanadský balzám •1. roztěry (z tekutin, v nichž jsou rozptýleny drobné objekty) •Druhy preparátů •Podle způsoby přípravy: •- vlhké (střevní prvoci) • • hem110 MS-HUSPERM GiardiaTroph(1) •Objekt: Giardia intestinalis •- suché (krevní roztěry, spermie) •2. Vlhká komůrka (visutá kapka s objekty) •Druhy preparátů •Podle způsoby přípravy: • • • • • • • • •Objekt: Volvox •3. Výbrusy (tvrdý materiál - kosti, zuby) • lupusarch_per •Objekt: kost bone1 •Druhy preparátů •Podle způsoby přípravy: •4. Řezové preparáty (histologické řezy – polotenké, tenké, tlusté řezy žiletkou) •5. Roztlaky (karyotypy) • image244 •Objekt: ledvina savce • 263_12 •Objekt: obří chromozómy, slinné žlázy larvy pakomára • •výhody: neporušený objekt • možnost pozorovat pohyb buněk • činnost organel - pohyb bičíků, řasinek, kontraktilní vakuoly •nevýhody: omezený výběr materiálu (velikost, sezóna) • časové omezení • malé rozdíly v přirozeném kontrastu •izolované buňky (krev, lymfa, leukocyty, roztlačené vazivo,chrupavka na řezech, pozorování buněčného dělení, průkaz vajíček, cyst nebo vegetativních stádií střevních parazitů ve stolici, tvar a struktura buněk kvasinek atd.) •drobné organismy •studium nativních preparátů - nejstarší metoda v biologii •Nativní preparáty •suché preparáty •přirozené prostředí - pro volně žijící organismy (voda sladká, mořská) umělé izotonické prostředí - fyziologický roztok, krevní sérum, NaCl v destilované vodě, Ringerův roztok, Lockeho roztok •kroužkovci - 0,45% NaCl •ryby, obojživelníci - 0,64% NaCl •plazi - 0,80% NaCl •ptáci, savci - 0,90% NaCl • •Tekutiny pro nativní preparáty • 4 •Pleurosigma (Diatomaceae) •Suchý preparát. Temné pole. •Mikroskop AMPLIVAL ZEISS Jena. • 1.Kapka média do středu podložního skla (pozor na velikost kapky) 2.Vložíme objekt, správně orientujeme 3.Přikryjeme krycím sklíčkem 4.Stolek mikroskopu ani podložní sklo nesmí být vlhké 5.Médium nesmí být na krycím skle 6.Přebytek média – odsajeme od hrany krycího skla 7.Nedostatek média – přikápneme k hraně krycího skla – prosaje se 8.V preparátu nesmějí být bubliny •Příprava nativního preparátu 4 5 C:\Users\maria-lujza\Desktop\kvapka.jpg •Jak položit krycí sklíčko? •- hranou na podložní sklo pod úhlem 45°, podepřít jehlou a přiklopit •- uchopit za hrany do dvou prstů, položit kolmo shora •Příprava nativního preparátu •Barvení (buněk, tkáně) za živa je vitální barvení •Do živé buňky pronikají pouze tzv. vitální barviva •Vodné roztoky barviv o nízké koncentraci •(zásobní 0,5 -1%, k použití se silně ředí - až 0,05% •možnost rozpustit ve fyziologických tekutinách •Barvení je biochemická metoda, kterou se přidá k objektu specifická barvící látka (barvivo) a slouží k prokázání výskytu (kvalifikaci) nebo množství (kvantifikaci) specifické látky ve zkoumaném objektu nebo ke zvýraznění vnitřních struktur. •Vitální barvení • •Objekt: ameba •Médium: voda •Barvení: vitální LOBO001P •Intravitální •Barví se normální živé buňky, přímo v těle organismu •Drobné objekty se vkládají přímo do nízkoprocentních roztoků těchto barviv, nebo se vstřikují do živého organizmu (obratlovci) •nebo tzv. prosáváním • • •Příklad: •neutrální červeň - potravní vakuoly vakuoly • • • • •Filtrační papírek • • • • •Druhy barvení • •Médium: voda •Barvení: vitální •Objekt: •Paramecium caudatum • 306P_caudatum.jpg •Supravitální - barvíme živé buňky vybrané z těla (kousky tkáně) • • •propustnost membrán je větší u oslabených buněk •Druhy barvení •Supra vital stain in hemoglobin H disease that reveals Heinz bodies (golf ball appearance). • 954354-958850-1025 •Postvitální - barví se odumírající buňky • •Příklad: •metylová zeleň - makronukleus nálevníků • •Druhy barvení S16 •Spirostomum minus which I stained with Methyl Green Acetic - the long macronucleus. • •Neutrální červeň •Barví potravní vakuoly - soustavy vakuol, tzv. vakuom ( potravní vakuoly u buněčného jícnu mají kyselý obsah – malinově červené, vakuoly vzdálenější jsou žlutočervené - alkalické prostředí) - změna chemizmu během cyklózy (tj. cytoplazmatického proudění – distribuce živin, metabolitů, organel, ….). NČ je indikátorom pH daného prostředí. Používaná koncentrace 1:50 000 – 100 000. •Kongo červeň •Barví potravní vakuoly a cytoplazmu ( u jícnu modré, vzadu červené - v závislosti na kyselosti). Používaná koncentrace 1:10 000. U perlooček barví chemoreceptory na antenulách. •Janusova zeleň B •Barví mitochondrie černě (drobné černé tečky v plazmě). 1:10 000 •Metylénová zeleň •Příklad barvení postvitálního, zabarví makronukleus odumírající trepky (je velmi citlivá na alkalické prostředí, proto se používá v slabě kyselém prostředí- do 1% vodního roztoku kápneme několik kapek kyseliny octové) •Metylová modř • - obsah vakuol tmavomodrý, u živočichů též neurony •Metylová violet • - cytoplazmatické granulky na fialovo, po delší době i jádro • •Barviva a selektivní vazba barviva na určité buněčné struktury • Pro pozorování v mikroskopu nutno zpomalit rychlý pohyb trepky Používá se: • nejjednodušší je mírný tlak na krycí sklo pomocí jehly (!!! pozor na rozdrcení objektů) • zaklínění mezi řasy a detrit • komůrky z vaty • zahuštění prostředí: 1%agar- 1 kapka zahřátá na 40oC rosol se semen druhu Cydonia vulgaris (kdoule) 3% roztok želatiny nebo metylcelulózy řídký škrob • narkotizace: parami éteru, dioxid uhličitý, metylalkohol, chlorid horečnatý, kyselina octová • ochlazení preparátu •Úkol č. 1 Modelový organismus – trepka (Paramecium sp.), zhotovení nativního preparátu, vitální barvení 1.Na podložní sklo kápneme kapku vody s trepkami 2.Vložíme rozcupovanou vatu a přikryjeme krycím sklem (zpomalení pohybu) 3.Pozorujeme práci kontraktilních vakuol 4.Barvíme: • a) intravitálně neutrální červení – potravní vakuoly (různé pH) • b) postvitálně metylenovou zelení – • makronukleus •Trepky: „zrnková“ kultura •- zpomalení pohybu: (vlákna vaty, želatina, metylcelulóza, páry éteru, kyselina octová) •Úkol č. 1 Modelový organismus – trepka (Paramecium sp.), zhotovení nativního preparátu, vitální barvení • Soubor:Trapka velka Paramecium caudatum.jpg •Trepka se rozmnožuje většinou nepohlavně. Jedinec vyroste na dospělém a jednici a po čase se oddělí. Trepky mají i pohlavní rozmnožování. Nazývá se konjugace. Jedinci splynou buněčnými ústy, generativní jádro prodělá redukční dělení, vegetativní se 2X rozpadá. Následuje vznik 4 jader, 3 z nich zanikají a čtvrté se haploidně rozdělí na 2. Jádra v buňkách splynou v synkarion. Konjuganti se rozestoupí. Následují 3 za sebou jdoucí jaderná dělení. Výsledkem konjugace je vznik 8 trepek. http://imgc.artprintimages.com/images/art-print/michael-abbey-paramecium-caudatum-ciliate-protozoa- conjugation-or-sexual-reproduction-phase-contrast_i-G-38-3816-HLBYF00Z.jpg •Konjugace trepek – fázový kontrast http://www.uwlax.edu/biology/Zoo-Lab/Images/Lab-03%20Images/Lab-3-12.jpg