Studium buněk I kultivace Jiří Novák Podzim 2016 Buněčná (tkáňová) kultura • In vitro kultivace (eukaryontních) buněk, tkání nebo orgánů v definovaných podmínkách Mikroorganismy -bakterie • Bakterie – prokaryontní stavba buňky – Jednobuněčné organismy – Jediný kruhový chromosom+ plasmidy – Odlišná proteosyntéza od vyšších organismů Mikroorganismy -kvasinky • Kvasinky – eukaryontní stavba buňky – Jednobuněčné organismy – Buněčná stěna – Stejný typ proteosyntézy jako u vyšších organismů Eukaryontní buňky • Živočišná buňka • Rostlinná buňka – Buněčná stěna – Vakuola – Plastidy – Plasmodesmata Srovnání buněčných kultur Buněčná linie Výhody Nevýhody Bakteriální -jednoduchost buňky -rychlý růst/krátký generační čas -nízká náročnost na kultivaci -jednoduchost buňky -proteosyntéza odlišná od eukaryot -nízká relevance k vyšším organismům Kvasinková -rychlý růst/krátký generační čas -nízká náročnost na kultivaci -odlišnost fyziologie od živočišné buňky - nižší relevance k vyšším organismům Živočišná -vysoká relevance k vyšším organismům -složitost kultivace -relativně pomalý růst -náchylnost je kontaminaci Mikroorganismy Mikroorganismy Bakterie + kvasinky • Média: – Složení- např. hydrolyzát masa, kvasinek, slad, krev Členění: – Podle konzistence • Tekutá média (bujóny) – často stejnoměrný růst (zákal), nemožnost rozlišení různých druhů ve směsné kultuře, slouží k namnožení kultury • Pevná média (agarové půdy, cca 3 % agaru)- možnost klonální selekce • Polotuhá média (0,5-2 % agaru)- výzkum motility bakterií • Dvojfázová média – Podle nutričních komponent • Jednoduchá • Komplexní • Syntetická (definovaná) – Podle funkce • Bazální (pepton, …) • Obohacená –doplněná o živiny – (krevní agar, čokoládový agar,…) • Selektivní – – např. antibiotika, pH, salinita, barviva,… • Diagnostická (změna barvy, hemolýza,…) Mikroorganismy • Snadná klonální selekce mutantních jedinců Mikroorganismy Klonální selekce metodou razítka (replica plating) Mikroorganismy Využití ve vědě: - Produkce látek (proteinů, antibiotik,…) Příklad využití • Amesův test mutagenity – Salmonella typhimurium TA 98, His- Eukaryontní buňky (živočišné) Proč kultivovat buňky in vitro • Nástroj pro studium fyziologie organizmu ve zjednodušené formě – Napodobení chování buněk v in vivo prostředí (rakovinné buňky) – Vysoce selektivní a definované prostředí umožňující ovlivňování většiny parametrů ( optimalizace růstu, mezib. Komunikace…) – Studium homogenního materiálu (práce s klonální linií identických buněk) • Testování toxicity in vitro • Virologie- studium virů a produkce vakcín • Genetické inženýrství- produkce komerčních proteinů, velkoprodukce vakcín,… • Genová terapie – náhrada buněk s nefunkčním genem „opravenými“ buňkami Historie eukaryontních buněčných kultur • 1878: Claude Bernard navrhoval, že fyziologické systémy organismu je možné udržovat při životě i po smrti organismu. • 1885: Roux choval buňky kuřecího embrya ve fyziologickém roztoku. • 1897: Loeb ukázal, že krvinky mohou přežít v séru a plasmě • 1903: Jolly pozoroval buněčné dělení mločích leukocytů in vitro • 1907: Harrison kultivoval žabí neurony metodou zavěšené kapky. Neurony rostly několik týdnů.. • 1910: Burrows – dlouhodobá kultivace kuřecích embryonálních buněk – detailní pozorování mitózy. • 1911: Lewis vytvořil první tekuté médium z mořské vody, séra embryového extraktu a peptonu. První kultivace buněk v monovrstvě. • 1913: Carrel zavádí striktní aseptickou techniku kultivace, která umožňuje dlouhodobé udržování kultur. • 1916: Rous a Jones začali používat trypsin pro pasážování přisedlých kultur. • 1923: Carrel a Baker vyvinuli „T-flask“ první speciální kultivační nádobu na buněčné kultury umožňující kontrolu pod mikroskopem. • 1927: Carrel a Rivera vyrobili první virovou vakcínu (vaccinia). • 1933: Gey vyvinul kultivaci v otáčející se trubici • 40. léta 20. stol : Pen-strep- zavedení antibiotik do kultivace. • 1952 - George Gey: první kontinuální lidské b. HeLa (Henrietta Lacks, buňky z nádoru děložního čípku, 70-80 chromozómů, do té doby se předpokládalo, že nádorové buňky nelze kultivovat, ukázalo se však, že naopak rostou rychleji a jsou méně náročné na vnější podmínky). Zásadní objevy • Antibiotika- inhibice růstu kontaminace • Trypsin- proteolytický enzym umožňující pasážování adherentních kultur • „Definované“ kultivační medium Typy buněčných kultur Typy buněčných kultur • Kultivace orgánů ex vivo (např. perfused heart) – životaschopnost 2-3 h • Kultivace tkání in vitro – životaschopnost 4-6 h, zachována struktura tkáně • Primární buňky/linie • Kontinuální buněčné linie • Subcelulární frakce (např. mikrosomální) – definované podmínky, nízká relevance k in vivo komplexita, relevance míra definovanosti Primární kultury • Buňky chirurgicky a/nebo enzymaticky odebrané z organizmu a přenesené do vhodného prostředí, které jsou schopné růstu – dvoukroková kolagenázová promývací technika • Po odběru dochází k dediferenciaci – ztráta mezib. spojů → proliferace – ischemické poškození → zánět, spontánní apoptóza • Rozkultivování primárních buněk vede ke vzniku buněčných linií • Omezená životaschopnost- po několika děleních zestárnou a odumírají (hepatocyty cca 4 dny) Kontinuální buněčné linie • Většina primárních buněčných linií má omezenou životnost- po několika děleních se přestanou množit • Kontinuální linie: – Rakovinné linie (nejběžnější) • Rychlý růst, nižší závislost na obsahu séra v médiu a potřebě zakotvení – rostou víc v suspenzi • Nestabilní genotyp • Schopnost růst do vysoké denzity • Odlišný fenotyp od buněk původní tkáně • Ztráta exprese tkáňově specifických genů – Imortalizované linie • Spontánně (někdy záměrná indukce mutageneze) výskyt záleží na druhu organizmu • Pomocí transdukce virem deregulujícím b. cyklus (HPV, EBV, SV40 T …) • Umělá exprese/inhibice klíčových molekul- (např. telomeráza (hTERT), siRNA Rb nebo p53) • Hybridoma –fúze buňky s požadovanou funkcí s rakovinnou buňkou (např. fúze B lymfocytu s myelomem ->produkce protilátek) • Relativně stabilní genotyp • Relativně vyšší podobnost s buňkami in vivo oproti rakovinným modelům Vlastnosti buněčné linie • Adherentní, suspenzní • Generační doba - období mezi dvěma mitózami (tj. trvání buněčného cyklu). • „Doubling time“ – čas zdvojení, čas potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v populaci. • Růstová křivka - závislost počtu buněk na době kultivace. • Buněčný kmen populace buněk selektovaná na základě určitých specifických vlastností. • Klon je linie b. vzniklá z jediné buňky. • Linie transformované teplotně senzitivními onkogeny - při nižší permisivní teplotě se chovají jako nádorové (32°C), při vyšší jako nenádorové (nebo naopak) • Kontaktní inhibice -schopnost reagovat na hustotu buněk v okolí- rakovinné kultury ji většinou ztrácí Kmenové buňky self-renewal self-renewal self-renewal Terminálně diferencované buňky Proliferačnípotenciál Potence Diferenciace Izolace & Reprogramování (2007 - člověk) Izolace (1998 - člověk) Indukované pluripotentní buňky (iPSC) Izolace (1997 - člověk) Embryonální kmenové buňky (ESC) Dospělé kmenové a progenitorové buňkyDospělé (tkáňově-specifické) kmenové buňky – Normální nenádorové buňky organismu – Symetrické (self-renewal) a asymetrické dělení (diferenciace) – Schopnost kontinuální kultivace – Vývoj protokolů pro jejich in vitro diferenciaci do požadovaných typů buněk KMENOVÉ BUŇKY Příklad použití: Hepatotoxicita – Játra – hlavní detoxikační orgán – Biotransformace / bioaktivace toxických látek – Permanentní jaterní linie (např. HepG2) – nízká aktivita detoxikačních enzymů – malá relevance Gen Genová exprese Izol.hepa- tocyty HepG2 CYP2B6 100 0.5 CYP2C9 100 0 CYP3A4 100 0 UTG1A1 100 5.2 AldB 100 0 Albumin 100 12.3 In vitro diferenciace hESC do „hepatocyte-like cells“ (Greenhough 2010, Toxicology 278) (Guillouzo 2010, Toxicology 270) KMENOVÉ BUŇKY Fibroblasty dárce / pacientaBlastocysta Jaterní biopsie Reprogramování Indukované pluripotentní buňky Dospělé kmenové buňkyEmbryonální kmenové buňky Hepatocyte-like cells Upraveno dle Greenhough 2010, Toxicology 278 Kultivace Potřebné vybavení • Sterilní box- (flow box, laminární box) • Inkubátor- teplota 25-30 oC pro hmyz, 20 oC pro ryby, 37 oC savčí buňky, CO2 2-5% & 95% vzduchu při 99% relativní vlhkosti • Chladnička/mraznička- uchovávání roztoků (média, trypsin) 4 oC, sérum a součásti média -20 oC • Invertovaný mikroskop • Kultivační materiál – plastový/skleněný (lahve, pipety,…) • buňky nemají imunitu → náchylné ke kontaminaci • Nutnost (semi-)sterilní práce • Sterilizace materiálu a povrchů: – Zářením (UV,γ) – Teplem (suchým, vlhkým (autoklávování)) – Filtrací ( 0,2- 0,1µm filtr) – Sterilizační roztoky- 70% EtOH, SAVO Růstová média • Snaha vyvinout plně definované médium (jehož složení je přesně známé a neměnné) • Běžná média (např. DMEM –Dulbeccovo modifikované Eaglovo medium) – Definovaná složka: 90-95 % -vodný pufr (pH 7,2-7,4) obsahující kombinaci solí, sacharidů, lipidů a aminokyselin (nejen esenciálních) – Nedefinovaná složka: 5-10 % fetální bovinní sérum (FBS) – směs růstových faktorů, hormonů atd. nutných pro růst – Někdy –antibiotika (pen-strep, gentamicin), pH indikátor Náhrada séra: ITS –inzulin, transferin, selen – Definovaná kombinace růstových faktorů – většinou sérum plně nenahradí ale umožňuje snížit množství séra v médiu Metody kultivace Klasický přístup 2D kultivace • V Petriho miskách / kultivačních lahvích – Suspenzní – Adherentní • Na plastovém povrchu • Na „feeder layer“- vrstva např. chemicky inaktivovaných buněk • Na vrstvičce želatiny, kolagenu • Na náhražce extracelulární matrix (např. Matrigel) Zabezpečení konstantních podmínek kultivace • semi-statická kultivace • Periodická výměna média • Většina linií vyžaduje neustálý růst (udržování v log fázi růstu) → nutnost pasážování – Udržení stabilních vlastností kultury • Pasáž – Oplach buněk PBS – Trypsinizace – Inhibice trypsinu přídavkem média s FBS – Resuspendace – Rozdělení v pasážovém poměru (1:1-20) Schéma pasážování In vitro vs in vivo In vitro In vivo Rychlá proliferace Pomalá proliferace Buněčná monokultura Interakce různých typů buněk Monovrstva buněk (2D) 3D struktura Malý kontakt mezi buňkami/nepolarizované buňky Silná interakce mezi buňkami/ funkční polarizace buněk Semistatická kultivace Průtoková kultivace Umělý materiál ECM Vysoká koncentrace O2 Často hypoxické podmínky- gradienty Vliv na fenotyp buněk : změna diferenciace, exprese genů, metabolismu, proliferace, viability Moderní přístupy • 3D kultivace – Kultivace v zavěšené kapce – Mikrogravitace – Funkční polarizace buněk – Různé druhy povrchů (kolagen, fibronektin, lamin, Matrigel) – Decelularizované orgány (srdce, játra) • Odmytí buněk detergentem, náhrada buněčnou kulturou • Sferoidy/organoidy (shluky buněk) – Směs diferencovaných, progenitorových, dospělých kmenových buněk – Vliv gradientu kyslíku ve sferoidu • Kultivace v hypoxických podmínkách – Inkubátory se řízenou hladinou kyslíku • Mikrofluidní kultivace Decelularizace/recelularizace orgánů • Odmytí buněk detergentem • „lešení“ orgánu • Znovuosídlení lešení buněčnou kulturou (progenitory, kmenové buňky) • Snaha vyvinout transplantovatelné orgány na míru Maher 2013 Nature http://www.sciencebuzz.org/buzz_tags/decellularization Kultivační inzerty • Plastové inzerty s propustnou membránou • Směsná kultura více typů buněk • nepřímý kontakt buněk • Různá expozice shora a zdola → funkční polarizace buněk • ALIC air-liquid interface cultivation (model plicní tkáně) Uchovávání buněk • V zamraženém stavu – -70-80°C – životnost týdny až měsíce – <–150°C v tekutém dusíku, životnost roky • Kryoprotektans: – 5-10% sérum – 5-10% DMSO (koncentrace je pro buňky jedovatá!) Kontaminace buněčné kultury • Chemická- špatně detekovatelná, endotoxiny, plastifikátory, kovové ionty, zbytky desinfektans- často nenápadné účinky • Biologická- infekce mykoplasmami, kvasinkami, bakteriemi, houbami, kros-kontaminace s jinou buněčnou linií Účinky biologické kontaminace • Kompetice o živiny • pH- produkce kyselých nebo alkalických metabolitů • Degradace argininu a purinu - ↓ syntéza histonů a DNA • Produkce toxického peroxidu Detekce kontaminace • Většinou zakalení/změna barvy média • Bakterie, kvasinky a houby jsou viditelné mikroskopem • Změna charakteristik růstu (špatná adheze, pomalý růst, změna struktury cytoplasmy) • Mycoplasmy- nitrobuněční paraziti – nejmenší živé organismy – proniknou běžnými ster. filtry – zdrojem kontaminace je člověk – detekce barvením DNA (DAPI, Hoechst 33258), EIA, PCR • Nejstarší a nejlepší metoda je infikovanou kulturu vyhodit (pokud je za ni náhrada) Použití antibiotik Lépe kultivovat bez antibiotik (mohou ovlivnit fyziologii buněk) – náročné na sterilitu - proti bakteriím, kvasinkám, plísním a mykoplazmám Vlastnosti vhodných antibiotik: - nesmí inhibovat růst a ani ovlivňovat metabolismus b. - musí ochraňovat kulturu po celou dobu experimentu - netoxické a bezpečné pro uživatele - kompatibilní s ostatními složkami média - rozpustné v netoxických rozpouštědlech Antibiotikum likviduje penicilin/streptomycin G+, GAmpicilin G+, GAmphotericin B kvasinky, plísně Gentamicin sulfát G+, G-, mykoplazmy Kanamycin sulfát kvasinky, plísně Tylosin sulfát G+, mykoplazmy Postup experimentu Kultivace – rutinní pasážování Nasazení – příprava buněk na experimentální zásah, vysetí definovaného počtu b. Expozice – experimentální zásah Stanovení endpointu metody (detekce) Vyhodnocení Schéma b. modelu s reportérovým genem • Vložení reportérového genu do genomu buňky pod transkripční kontrolou zájmového receptoru • Reportérové geny: Luciferáza, zelený fluorescenční protein (GFP), β-galaktozidáza, ... • běžně používané receptory: estrogenový, androgenový, arylhydrocarbonový,... Expozice • Petriho misky – složité na manipulaci → • Vícejamkové desky (6, 12, 24, 48, 96, 384, 864, 1536) • HTS – high throughput screening – využívané často ve farmakologii – Metody zvyšující efektivitu testování (až 100 000 látek denně) – Miniaturizace (mnohojamkové desky) – Robotizace/automatizace • Výsev desek • Příprava ředicích řad • Expozice • Měření – Metoda (assay)• levná, miniaturizovatelná • nenáročná na manipulaci (přepipetovávání, oplachy) • Vysoky poměr signál/šum – Detekční koncovka • Fluorescence- vysoká citlivost, nízká cena, problém s autofluorescenčními vzorky • Luminiscence – vysoká citlivost, vyšší cena • Radiometody – extrémní citlivost, náročnost na vybavení a provedení, dlouhé měření. V HTS se moc nepoužívá pokud je alternativa HTS 1 cyklus -> 230s Běh přes noc (16h): -> 250 mikrodesek -> 384 000 testů Mikrofluidní systém Litograficky vytvořený miniaturizovaný bioreaktor • fluidní kultivace/expozice Materiál -poly-dimethylsiloxan (PDMS) - Lab on chip / organ on chip - organ on chip Využitelný v HTS Mehling and Tay 2014 Curr. Opin. Chem. Biol. http://www.elveflow.com/microfluidic- reviews/review-microfluidic-for-cell- biology Mikrofluidní systém- organs on chip (Huh et al. 2012 Lab Chip) Mikrofluidní model člověka https://www.youtube.com/watch?feature=player_ embedded&v=S6t30-abqCY