Studium buněk II Metody Jiří Novák Podzim 2016 Cytotoxicita Metody stanovení životaschopnosti/cytotoxicity Sledované parametry životaschopnosti: • Mikroskopické pozorování • Barvení – propidium jodid- fluor. barva- detekce mrtvých buněk (flow cytometrie, počítání v Buerkerově komůrce) – trypanová modř – barví mrtvé buňky • Metabolizmus např. aktivita mitochondriálních enzymů – MTT (XTT) – spektrofotometrické stanovení formazánu vznikajícího ze substrátu, nutnost lyzace buněk – Alamar-blue – fluorescenční detekce přeměněného substrátu v živých buňkách – detekce hladiny ATP – např. cytotoxGlo (Promega) - luminiscence • Integrita membrány – Laktát dehydrogenáza (LDH) – detekce intracelulární LDH v médiu → marker propustné tj. porušené membrány – CFDA-AM – substrát projde narušenou membránou → metabolizován na fluorescenční formu • Integrita/funkce lysozómů – Neutral red uptake (NRU) – neutrální červeň projde membránami → protonizace v lysozomech (kyselé prostředí) → kumulace, spektrofotometrická detekce po lyzaci • Sledování růstu b. v reálném čase – RTCA real time cell analysis (sledování adheze/růstu buněk)  stav b. kultury  hodnocení experimentálního zásahu Apoptóza (Řízená buněčná smrt)  Kondenzace jádra  Rozrýhování membrány  Fragmentace DNA (brzká, násobky 180bp)  Apoptotická tělíska  Fagocytóza tělísek  Bez zánětu Nekróza (Pathologická buněčná smrt)  Buňky se zvětšují a lyzují  Lyzát poškozuje okolí → zánět  Nespecifická fragmentace DNA (pozdní, různorodá délka fragmentů)  Rozšířený zánět Apoptóza • Vnitřní cesta aktivace (intrinsic)- řízena mitochondriemi (uvolnění cytochromu C) • Vnější cesta aktivace (extrinsic) – vyvolána extracelulárními faktory např. TNFα, Fas ligandem • Hlavní efektory- caspázy (Cysteine Aspartate Specific ProteASEs) Detekce apoptózy • Testy viability – nespecifické, zjistí pozdní fázi apoptózy • caspázy (western blot, biochem. aktivita, immunostaining) • Detekce změn v membráně (Annexin V – vazba na membránu apopt. b.) • Detekce uvolnění Cyt C- ELISA, western blot v subcelulární frakci • Kondenzace/fragmentace chromatinu- fluor. barvy DAPI, Hoechst (postupující apopt. zvyšuje propustnost membrány) mikroskopie, flow cytometrie, elektroforéza • TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT) mediated dUTP nick end labeling), TDT naváže značený (fluorofor, biotin) dUDP na 3’konce DNA Video apoptóza / nekróza Buněčná smrt Okada and Mak, Nat. Rev. Cancer 4:592-603 Metody RTCA – real time cell analysis (xCelligence) • Testy cytotoxicity – ? Stav buněk během experimentu? • RTCA – informace o stavu buněk po celou dobu experimentu – Neinvazivní – Sledování impedance na zlatých elektrodách na dně jamky Stanovení: Cytotoxicita Buněčná adheze/proliferace/diferenciace Aktivace receptoru Invaze/migrace Vliv ko-kultivace RTCA – real time cell analysis (xCelligence) Migrace/invaze buněk 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 24 48 72 96 %kontroly Doba ko-kultivace (hod) 30 tis 7,5 tis 1,88 tis 0,94 tis Vliv ko-kultivace na růst buněk . Závislost růstu Leydigových TM3 buněk na počtu nasazených Sertoliho TM4 buněk na insert v jejich ko-kultivaci (Albrechtová 2013) Elektrofyziologie • Studium funkce iontových kanálů v buňce • Základní metoda- Patch clamp – Mikromanipulační metoda separace oblasti plazmalemy a studia její elektroaktivity – Umožňuje studovat aktivity celé buňky nebo jediného kanálu v membráně Metody založené na reportérových genech • Reporter gene assays • stanovení transkripční aktivity v rámci buněčné odpovědi na podnět (např. aktivace receptoru) • Vložení gen. konstruktu – promotor- reportér- selekční gen (např. neo rezistence ke geneticinu (G418)) • příklady reportérových genů: ß-galaktozidáza; luciferáza; alkalická fosfatáza; zelený fluorescenční protein (GFP) Transfekce Transfekce • Přenos cizí RNA nebo DNA do eukaryotické buňky (bez použití viru) – Stabilní – cizí DNA se zabuduje do genomu (selekční gen např. neo - rezistence k G418)- DNA se předává i potomkům – Dočasná (transientní) – DNA není v genomu, k expresi dochází po krátký čas (24-96 h) Problém: dostat záporně nabitou molekulu DNA přes záporně nabitou membránu Metody: fyzikálně (mikroinjekce, elektroporace, na částicích) chemicky (pomocí lipidů, solí, makromolekul) biologicky (viry- transdukce) • Chemická cesta: – -neutralizace náboje DNA, • fosfát vápenatý- precipitát DNA nasorbovaný na buňky→inkorporace • Lipid nebo polymer- obalí DNA a je endocytován Vápníková metoda Lipozómová metoda Fyzikální metody transfekce – Elektroporace – pulzy vysokého napětí → krátkodobé póry v membráně → inkorporace DNA – Mikroinjekce – transfekce embryonálních kmenových buněk – Biolistic particle delivery – „nastřílení“ zlatých nebo wolframových částic s DNA do buněk pomocí genové pistole – Magnetické korálky – DNA na magnetických částicích → přenos do buňky působením magnetu Transdukce • Transfekce virem (transdukce) Fluorescence Fluorescence • emise světla po absorpci elektromagnetického záření • Citlivá a levná detekční koncovka • Problém: – fotobleaching „vysvícení“ – ztráta fluorescenčních vlastností na světle – „quenching“ – zhasínání fluorescence – místo emise se energie přenese jinam – autofluorescence vzorku- fluoreskuje něco jiného než chceme – Vhodná kombinace fluoroforů Řešení autofluorescence – Fluorescenční polarizace – • Velký fluorofor (GFP) • Malý fluorofor vázaný na makromolekulu (fluorofor vázaný na dextran) • - excitace polarizovaným světlem • velký fluorofor se mezi excitací a emisí nestihne otočit→ emituje polarizované světlo • porovnání intenzity polarizovaného a nepolarizovaného emisního kanálu odhalí signál studovaného fluoroforu Řešení autofluorescence – Časově rozlišená fluorescence (TRF) • Fluorimetr měří s časovým odstupem po excitaci → měření déletrvající fluorescence • Většina kontaminantů emituje dříve → zvýšení citlivosti fluorescence – Fluorescence resonance energy transfer FRET • detekce přiblížení dvou fluoroforů např. vazba ligandu na receptor • Donor je excitován a přenese energii na akceptor Pozorování b. kultur • Invertovaný mikroskop – Pozorování v procházejícím světle – Pozorování v odraženém světle (často fluorescence) Fluorescenční mikroskop • Využití vhodných fluoroforů (DAPI, GFP,…) • Studium vnitřní struktury buněk • immunostaining Konfokální mikroskopie – Eliminuje zkreslení odraženým světlem od nezaostřených oblastí – Umožňuje pozorovat materiál po „vrstvách“ a složit výsledný obraz Elektronová mikroskopie • Světlo (fotony) neumožňují pozorovat objekty s velikostí blízké jeho vlnové délce • Příprava vzorků – Fixace, barvení těžkými kovy,… (biologický materiál je pro e- průhledný) • Typy elektronové mikroskopie – Transmisní (TEM) – průchod svazku elektronů tenkým vzorkem – Skenovací (SEM) – skenování povrchu vzorku svazkem elektronů – Skenovací- transmisní (STEM) – podobné TEM ale obrázky vznikají skenováním Immunostaining • Barvení vzorku pomocí značených protilátek Identifikace/lokalizace zájmových molekul ve vzorku (kde, kdy, kolokalizace/koexprese) • Nutnost mít specifickou protilátku proti žádanému antigenu Typy značení protilátek • Fluorescenční –fluoresceční mikroskopie- vyšší rozlišení • Enzymatická (HRP)- western blot- vyšší citlivost • biotin /avidin – nejsilnější nekovalentní interakce mezi proteinem a ligandem (Kd=10-15 M; protilátky mají cca Kd=10-7 M) Typy barvení: • Přímé – značená specifická protilátka • Nepřímé- specifická protilátka + sekundární značená protilátka (zesílení signálu + ušetření za značení ) např. primární myší protilátka proti tubulinu detekována sekundární anti-mouse kozí protilátkou Vzorky • Buňky • Tkáně – anatomické preparáty • Proteiny (Western blot) Flowcytometrie • Studium suspenzních buněk • Detekce povrchových markerů buněk • Detekce intracelulárních faktorů • Detekce obsahu DNA • Možnost třídění do subpopulací Detekce - flowcytometrie Zdroj světla: laser • Side scatter – detekce vnitřní komplexity • Foreward scatter – detekce velikosti Detekce fluorescence Populační analýza Skenovací cytometrie • Použití metody flowcytometrie na přisedlé buňky • Nafocení řady snímků v různých fluorescenčních kanálech • Možnost sledování v čase (časově závislé děje, pohyb buněk) • Sledovaný materiál (na sklíčku, na misce, v desce) – Části tkáně (histologické preparáty) – Adherentní buňky – Buněčné suspenze • Získání dat – Předběžný sken – Výběr oblasti zájmu – Podrobné snímkování Analýza obrazu • Identifikace buněk podle prahového signálu • Často identifikace DNA • Využití – Počítání buněk (proliferace, motilita) – Studium morfologie buněk – FISH Analýza obrazu • Rozšíření kontur – analýza kontur oblasti cytoplasmy • Periferní kontury – zahrnutí signálu v oblasti povrchu buňky Analýza obrazu • Vytvoření virtuálních kanálů • Zahrnutí informací potřebných pro analýzu Flowcam • Analog flow cytometru• Vyfotí procházející částice • Vytváří katalog • Analýza obrazu