Jméno:                                                 Datum:

PROTOKOL qRT-PCR

1.     Zpětná transkripce:

A.     Spočítej, kolik ul celkové RNA vašeho vzorku představuje 1 ug RNA, který jsme vložili do
zpětné transkripce.

Koncentrace RNA 0,1% DMSO: 680,35 ng/ul                                              Výsledek:

Koncentrace RNA 10 nM TCDD: 448,85 ng/ul                        Výsledek:


B. Spočítej, jaká je výsledná koncentrace směsi nukleotidů, když do reakce vstupují 2 ul 10 uM
směsi nukleotidů  a celkový objem je 40 ul.
Výsledek:



C. Spočítej, jaká je výsledná koncentrace směsi nukleotidů, když do reakce vstupují 2 ul 20 uM
směsi primeru poly(dT)  a celkový objem je 40 ul.                                     Výsledek:


2.  Kvantitativní real time PCR

 1.  Do každé jamky (20 ul) patří:

      1,5ul cDNA templátu (DMSO nebo TCDD)

      18,5 ul Master mixu:

*        3 ul 2xcc Roche - LighCycler 480 SYBR green I master kit (směs nukleotidů, FastStart Taq
DNA polymeráza, SYBR green, MgCl[2])

*        0,375 ul každého z primerů  (SS 20 uM…. Vypočítej výslednou koncentraci)    Výsledek:

*        1,7 ul MgCl[2]  (SS 25 mM, vypočítej výslednou koncentraci)
Výsledek:

*        Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H[2]O
 2. Spočítej výsledky (viz výše).
 3. Doplň tabulku pro 1 a 4 jamky – 1 gen ………………………. – 2 vzorky v duplikátu:

SYBR green

            F(+) primer

                       R (-) primer

                                   MgCl[2]

                                          H[2]O

1 jamka

       3 ul

            0,375 ul

                       0,375 ul

                                   1,7 ul



                                          =18,5 ul

                                          13,05 ul

4 jamky

       12 ul

            1,5 ul

                       1,5 ul

                                   6,8 ul

                                          52,2 ul
 4. do malé eppendorf zkumavky napipetuj příslušné objemy napočítané pro 4 jamky. Rozděl Master mix
do dvou zkumavek odpipetováním 37 ul (jedna zkumavka je pro DMSO, druhá pro TCDD) a přidej do každé
3 ul příslušného cDNA templátu (pracujeme v duplikátu).
 5. Všechny složky reakce stále udržuj na ledu!!!!
 6. Přepipetuj vzorky do speciální desky pro LightCycler.
 7. Spusť kvantitativní real time PCR (LightCycler - Roche)
 8. Doplň teploty a délky trvání jednotlivých fází PCR:


 9. Doplň kolik cyklů bude reakce trvat:
10. Popiš analýzu „melting curve“ cílového genu:


11. Popiš, jakým způsobem získáme hodnotu Cp manuálním prahováním pomocí fit pointů:


12.   Popiš, jakým způsobem získáme hodnotu Cp pomocí 2. derivativu a srovnej výsledek s 11:




13.   Vypočítej relativní množství produktu

                                              Vzorek

                                                                                                 Cp průměr

                                                                                                            HPRT

                                                                                                                 DCp

                                                                                                                  2^-DCp

 ABC B1 DMSO





  ABC B1 TCDD





  ABC C1 DMSO





  ABC C1 TCDD





  ABC G2 DMSO





  ABC G2 TCDD





  HPRT DMSO





  HPRT TCDD






14.  Srovnej úroveň exprese svého genu s ostatními a formuluj závěr: