doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..
Izolace RNA
Metodiky izolace RNA
celková buněčná RNA („total“ RNA) zahrnuje řadu
typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými
vlastnostmi a tedy i nároky na jejich
izolaci;
více než 80 % buněčné RNA tvoří ribozomální RNA;
zbytek tvoří mediátorová „messenger“ RNA (mRNA;
cca 1 - 5 %), transferová RNA (tRNA) a různé typy
nekódujících RNA, vč. miRNA, lnRNA apod.
pro izolaci mRNA za účelem studia genové exprese
se využívají jak metody vhodné pro izolaci celkové
RNA, tak specifické postupy umožňující přípravu
„čisté“ mRNA;
Metodiky izolace RNA
dynamická regulace hladiny mRNA – detekce změn je
zásadní pro studium změn exprese specifických genů;
izolace celkové RNA – 2 základní metodiky:
extrakce pomocí organických rozpouštědel;
affinitní/adsorpční metody;
izolace mRNA – pomocí oligo(dT) substrátů – kuličky,
kolony apod.
jako zdroj – celková RNA;
přímo z buněčných/tkáňových lyzátů;
Důležité faktory ovlivňující izolaci RNA:
je třeba bránit degradaci RNA prostřednictvím
ribonukleáz (RNáz);
nedotýkat se vzorků, pracovat v rukavicích;
používat inhibitory RNáz, např. guanidin isothiokyanát
(GITC);
vedle proteinů je třeba také odstranit kontaminující
DNA;
základní kroky/cíle přípravy RNA:
rychlá a efektivní lýze buněk;
inaktivace RNáz;
denaturace komplexů nukleových kyselin s proteiny;
oddělení RNA od proteinů a DNA;
RNázy a ochrana před jejich působením
RNázy jsou běžný laboratorní kontaminant
(bakteriální a lidské zdroje) a uvolňují se během
procesů vedoucích buněčné lýzi;
ochrana: rukavice, používání RNase-free zkumavek,
špiček a chemikálií;
používání inhibitorů RNáz – především chaotropních
reagencií (GITC apod.) narušujících stabilitu
vodíkových můstků, hydrofobní interakce –
denaturace proteinů a jejich inaktivace;
Izolace RNA pomocí organické extrakce
homogenizace a
lýze buněk
vodná
fáze
organická
fáze
směs fenol:chloroform:isoamyl alkohol – inkubace
a centrifugace
vodná fáze obsahuje RNA, zatímco
genomová DNA a zbytky buněčného
materiálu vytvářejí úzkou vrstvu na rozhraní
vodné a organické fáze;
přenos RNA do čisté zkumavky – precipitace
a přečištění ethanolem a vysrážená RNA je
rozpuštěna ve vodě zbavené RNáz, příp. v
pufru;
Promega Corp.
Výhody a nevýhody metody
kompatibilní s různými typy vzorků a použitelná k
izolaci malých i velkých množství RNA;
nízké náklady;
nevýhodou je nutnost používání agresivních
organických rozpouštědel, časová náročnost a
omezené množství vzorků (není to high-throughput
metoda);
RNA může být kontaminována DNA;
Afinitní purifikace RNA
homogenizace a lýze buněk
nanesení lyzátu na kolonu (obsahuje jak nukleové kyseliny,
tak zbytky buněk;
promytí ethanolem – odstraní nečistoty, zatímco
nukleové kyseliny zůstanou navázány na membránu;
odstranění kontaminující DNA pomocí DNázy;
rozpuštění RNA ve vodě –
další zpracování;
Promega Corp.
Výhody a nevýhody metody
nepotřebujeme organická rozpouštědla; varianty
kompatibilní se širokým spektrem vzorků;
pomocí DNázy eliminujeme kontaminující DNA;
vysoce kvalitní RNA;
nevýhoda: nákladnější;
v rámci cvičení – afinitní purifikace RNA pomocí
kolonek;
Izolace mRNA
mRNA obsahuje polyA konec na 3’ konci molekuly;
to umožňuje využít oligo(dT) próby v různé formě k
izolaci mRNA;
hybridizace oligo d(T) s mRNA - separace vázané
mRNA (centrifugací, magneticky);
DNA
mRNA
pellet
Izolace RNA pomocí kitu
Izolace RNA pomocí kitu
Stanovení koncentrace a čistoty RNA:
spektrofotometricky
A260 – 1.0 ~ 40 g/ml
A260/A280 ~ 2.0
gelová elektroforéza;
RNA analyzéry;
Degradace RNA na gelové elektroforéze:
ribozomální RNA;
Nové technologie pro analýzu čistoty a
koncentrace NK
malý objem vzorku (1-2 mikroL);
velký dynamický rozsah (jednotky – tisíce ng
NK/mikroL);
kompletní spektrum (220 -750 nM);
rychlé měření, nepotřebujeme specif.
kapiláry/kyvety;
Nové technologie pro analýzu čistoty a
koncentrace NK
příklad: Agilent 2100 bioanalyzer
ribozomální
RNA