J. Hofmanová
Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity
Biofyzikální ústav AV ČR, Brno
Základy - buněčné kultury, cytokinetika
Moderní metody buněčné biologie 2015
http://www.ibp.cz/cs/oddeleni/cytokinetika/informace-o-oddeleni
těsná spolupráce s Odd. fyziologie a imunologie živočichů ÚEB, PřF MU
ODDĚLENÍ CYTOKINETIKY
VĚDECKÉ ZAMĚŘENÍ
Molekulární mechanismy zahrnuté v kontrole
buněčné proliferace, diferenciace, přežití/smrti
změny buněčného fenotypu a mezibuněčné
komunikace, které hrají úlohu ve vývoji nádorových
onemocnění a mohou být využity v protinádorové
terapii.
OKRUHY VÝZKUMU
Úloha lipidů a jejich metabolismu v rozvoji
nádorového onemocnění kolonu
Mechanismy působení dietetických mastných kyselin
(n-3 PUFAs, butyrát)
Působení protinádorových léčiv (platinové deriváty
v interakci s cytokinem TRAIL)
Role růstových faktorů v signalizaci nádorových
buněk prostaty (TGF beta, EMT, senescence), vliv
nádorového mikroprostředí
Molekulární a buněčné mechanismy toxicity
organických látek (PAHs, PCB, interakce
s dietetickými lipidy)
PŘENÁŠKY
A CVIČENÍ ZAJIŠŤOVANÉ ODD. CYTOKINETIKY
(Odd. fyziologie a imunologie živočichů, ÚEB, PřF MU)
Fyziologie buněčných systémů (Bi7070), prof. A.
Kozubík
Genotoxicita a karcinogeneze (Bi 8110),
prof. J. Hofmanová
Zdravotní rizika (Bi3871), prof. J. Hofmanová
Molekulární fyziologie živočichů (Bi651)
Mechanizmy buněčné smrti, význam, metody
– RNDr. Alena Hyršlová, Ph.D. (Bi8870)
Analytická cytometrie – Mgr. K. Souček, PhD.
(Bi9393)
Aplikovaná chemie a biochemie – Doc. Vondráček
(Bi5599)
TKÁŇOVÉ (BUNĚČNÉ) KULTURY IN VITRO
živočišné, rostlinné, hmyzí, rybí atd.
Živočišné buněčné kultury (získané z různých tkání např. hlodavců
jako je myš, krysa, křeček nebo opic, člověka)
PRIMÁRNÍ KULTURY – buňky získané přímo z živočišných tkání,
kousek tkáně, nutná disociace (rozvolnění) buněk a odstranění
nežádoucích částí, omezená doba kultivace, specifické požadavky
BUNĚČNÉ LINIE – adaptované na dlouhodobý růst in vitro
diploidní – karyotyp identický s živočišným druhem, z něhož byly
izolovány většinou omezený počet pasáží, stárnou a hynou (omezený
tzv. “life-span”)
heteroploidní – karyotyp a často i morfologie odlišné, dlouhodobá
kultivace. Udržují se tzv. pasážováním – určitý počet buněk se po
určité době přenese do čerstvého živného prostředí
ADHERENTNÍ kultury – rostou přichyceny k pevnému podkladu
(kultivační nádobky, mikronosiče)
SUSPENZNÍ kultury – nevyžadují podklad, rostou volně v médiu
The American Type Culture Collection
www.atcc.com
The European Collection of Cell Cultures
www.ecacc.org.uk
HLAVNÍ KOMERČNÍ DODAVATELÉ BUNĚČNÝCH LINIÍ
Organizmus
Orgán a typ tkáně
Adherentní x neadherentní
Jaké medium a sérum
Způsob pasážování
Podrobnosti, literatura atd.
KULTIVACE BUNĚK
Speciální plastikové lahvičky, misky různé velikosti – sterilní
Kultivace v živném médiu podle růstových a metabolických požadavků
buněk v termostatu s řízenou atmosférou – 37 °C, 95 % vlhkost, 5 % CO2.
Nutná přísná sterilita!!!! – sterilní roztoky, plastik. nádobky, sklo, pipety
atd., sterilizace autoklávem (120 °C), nebo horkým vzduchem (180 °C)
Práce ve sterilním laminárním boxu (typ BioHazard – laminární proudění
vzduchu, filtry – chrání i uživatele – práce s nebezpečnými viry apod.)
Základní médium je balancované chemické prostředí – zdroj pro energii
a biosyntézu.
Doplňky:
a) nedefinované složky – zvířecí séra (hovězí, telecí, fetální, koňské)
b) definované složky (růstové faktory, hormony atd.) – specializované
podle typu buněk
Živočišná séra
nejdražší součást média – ze zvířat z ekologicky málo poškozených
oblastí vhodné definované náhrady sér
Antibiotika a antimykotika
penicilin + streptomycin, gentamicin (i proti mykoplazmatům)
ZPŮSOB KULTIVACE
Suspenzní buňky – po spočítání buněk se část supenze doplní čerstvým
kultivačním médiem
Adherentní (přisedlé) buňky – uvolnění od podkladu a rozvolnění shluků
enzymy např. trypsinem, spočítání buněk, vysetí do čerstvého média.
Některé buňky vyžadují tzv. „feeder layer“ – vrstvu buněk inaktivovaných
zářením nebo chemicky sloužící jako podklad pro růst specifických typů
buněk
Kultivace ve sterilních plastikových lahvičkách se šroubovacími uzávěry nebo
v miskách různé velikosti – otevřený systém v atmosféře 5 % CO2.
Velkokapacitní kultivace – na mikročásticích ve velkých kontejnerech –
automatická výměna média
Uchovávání buněk v hlubokozmrazeném stavu (-180 °C – mraznice,
tekutý dusík) ve speciálních ampulích a kontejnerech několik let. Nutné
kryoprotektivum (proti tvorbě krystalů vody) – většinou dimetylsulfoxid nebo
glycerol.
Zmrazování je pomalé (řízené po 1 °C), rozmrazování rychlé – ponoření
ampulí do lázně 37 °C.
KULTIVACE BUNĚK
Udržování kultury –
pasážování
určitý počet buněk
se po určité době
přenese do
čerstvého živného
prostředí
Adherentní
– odsátí média
– oplach EDTA/PBS
– Trypsin
Neadherentní
– část kultury se přenese
do nového média
VYUŽITÍ BUNĚČNÝCH KULTUR
Buněčné kultury se staly nástrojem pro detekci
a objasňování mechanismů účinků buněčných
regulátorů a genů, které určují individuální aspekty
chování buněk.
Tato technologie umožnila pokrok ve virologii,
somatické buněčné genetice, endokrinologii,
toxikologii, farmakologii, hematologii, imunologii i ve
výzkumu karcinogeneze a stala se významným
nástrojem vývojové biologie, komplexní tkáňové
fyziologie a průmyslové výroby specifických
buněčných produktů.
Výhody
lze sledovat účinky různých faktorů a mechanismy studovaných dějů
bez nežádoucí interakce s buňkami jiných typů nebo tkání, účinku
humorálních faktorů i celkového stavu organismu
lze získat rozsáhlé populace buněk shodných vlastností a sledovat
jejich reakce v kontrolovatelných podmínkách
homogenita, reprodukovatelnost a množství materiálu umožňuje
studovat a odhalovat základní mechanismy vybraných aspektů
chování těchto buněk
specifické buněčné kultury lze využít k produkci a získávání množství
důležitých biologických látek (enzymy, hormony) – hybridomy
etické hledisko – systém omezuje využívání laboratorních zvířat
Nevýhody
umělý zjednodušený systém
poznatky nelze beze zbytku aplikovat na podmínky in vivo
Buňky nezralé (nediferencované nebo částečně diferencované)
buňky kmenové (toti- nebo pluripotentní)
buňky progenitorové
Jsou schopny sebeobnovy, mohou se dále dělit a diferencovat do
zralejších stádií.
Charakteristické pro embryonální stadium a v dospělém organismu pro
některé tkáně (krevní tkáň, střevní a kožní epitel, zárodečné buňky).
Schopné kultivace a dozrávání in vitro ve specifických podmínkách.
Buňky zralé – diferencované
Rozrůzněné podle typu tkáně se specifickými vlastnostmi. Nejsou
schopny se dále dělit, stárnou a umírají apoptózou (nervové, jaterní
buňky apod.)
Schopné kultivace in vitro omezený počet pasáží (diploidní stav) nebo
se z nich vytvářejí heteroploidní permanentní linie.
BUNĚČNÉ POPULACE IN VITRO
Imortalizované
z normální tkáně i nádorové linie
asynchronní
buňky se nacházejí v různých fázích buněčného cyklu –
přirozený stav
synchronní
buňky jsou ve stejné fázi buněčného cyklu – uměle navozené
různými chemickými látkami, homogenní populace, stejné
reakce
Využití zejména při výzkumu dějů vázaných na určitou fázi
buněčného cyklu nebo v praxi v nádorové terapii (léčba
cytostatiky)
EPITELIÁLNÍ BUŇKY
z lidské tkáně kolonu
línie HT29, CaCO2, HCT116 – nádorové buňky , FHC – fetální
střevo, NCM460 – nenádorové.
Schopnost diferencovat in vitro po působení butyrátu
sodného (NaBt):
růst aktivity alkalické fosfatázy
morfologické změny doprovázené polymerizací F-aktinu
výšení exprese adhezívních molekul – E-kadherinu
Vhodný model
pro studium regulace proliferace, diferenciace a apoptózy
epitelu střeva a mechanismů vzniku nádorů kolonu, působení
lipidových složek výživy a environmentálních polutantů
z lidské tkáně prostaty – nádorové i nenádorové linie
pro studium účinků cytokinů a nádorového mikroprostředí
Účinky butyrátu
SŘEVNÍ EPITEL – PŘECHOD ADENOM X KARCINOM
Buněčné línie
normální epitel
NCM460
fetální colon
FHC
Adenom
AA/C1
RG/C2
Adenocarcinom
HT-29
DLD-1
HCT-116
SW480
lymf.
Metastáza
SW-620
Pro ekotoxikologické studie jsou vhodné
jaterní buňky: primární hepatocyty (krysí), línie nádorových buněk
hepatomu (lidského nebo hlodavců), krysí jaterní fibroblasty
Geneticky modifikované buněčné línie
Linie transfekované různými zkoumanými geny nebo je postrádající
(„knock-out“)
Luciferase assay
vnesený gen s luciferázou – intenzita světla odráží aktivaci příslušných
vnitrobuněčných receptorů
pro detekci dioxinové aktivity (AhR), estrogenní aktivity ( ER) či aktivace
PPAR (peroxisome proliferator – activated receptors) studovaných látek
Intenzita světla měřena na luminometru.
VYBAVENÍ LABORATOŘE PRO KULTIVACE BUNĚK
Sterilní prostředí – speciální plastik, sklo, pipety (skleněné,
automatické – různé objemy)
autokláv, horkovzdušná sterilizace (130 °C)
Klimatizace, UV světlo
Destilační přístroj na superčistou vodu
Laminární box (Biohazard) – laminární proudění vzduchu, filtry –
sterilní prostředí pro práci, ochrana při práci
Inkubátor – 37 °C, 5 % CO2, 95 % vlhkost
Počítač částic (buněk)
Inverzní mikroskop
Centrifugy
ELISA reader
Cytocentrifuga
Fluorescenční mikroskop
Vysokoobrátková chlazená centrifuga (výměnné rotory)
Průtokový cytometr (FACSCalibur, Beckton Dickinson)
Několik laserů, stanovení několika parametrů současně
u rozsáhlých buněčných populace
FACSVerse
Fluostar – multifunkční přístroj – spektrofotometr, fluorimetr,
chemiluminometr
Zařízení pro molekulární biologii
Výkonná výpočetní technika
„Core facilities“ (Laboratoř molekulární biofyziky)
FACS Aria Sorb (BD) – vysokorychlostní buněčný sorter
Unikátní konfokální mikroskop Leica s vysokým rozlišením
MÉDIA
Řada druhů podle typu buněk (Eaglovo, Dulbecco, RPMI-1640), dodávají se
kompletní tekutá, koncentráty, prášková – skladování 40 °C.
Nutná kvalitní apyrogenní voda o vodivosti 0,2-0-1 S a chemikálie nejvyšší
čistoty. Nutná sterilizace přes filtr 0,2 m.
Základní složky
Glukóza (nebo galaktóza) a glutamin – zdroj energie a uhlíku
Aminokyseliny – zdroj energie a dusíku
Vitamíny – kofaktory pro enzymatické reakce
Lipidy – esenciální mastné kyseliny, cholesterol, etanolamin apod.
Anorganické soli – zajišťují osmolalitu, tlumí aciditu, nutriční faktor
Pufrační solné směsi – Earlův roztok (fyziolog. roztok s vysokým obsahem
NaHCO3) – kultivace v řízené atmosféře s regulovaným obsahem 5 % CO2
zabraňuje rozpadu a alkalizaci média.
Požadované pH většinou 7,2–7,4 – úprava HCl a NaOH
Otevřený systém – Petriho misky nebo lahvičky s povoleným uzávěrem
Optická kontrola – indikátor fenolová červeň
Organické pufrační systémy – HEPES 20mM
Nejčastěji používané fetální bovinní (telecí)
sérum (certifikát)
Metodologické přístupy
CYTOKINETIKA – chování buněk v čase
APOPTÓZA (anoikis)
APOPTÓZA
(poškozené buňky)
 kontinuálně se obnovující buněčné
populace
 řada zásadních fyziologických funkcí
 dynamická rovnováha mezi
přírůstkem buněk na bázi krypty
(proliferace) a úbytkem (apoptózaanoikis)
na povrchu
 regulace endogenními faktory
(hormones and cytokines), ale rovněž
složkami diety přítomnými v lumen
střeva
Endogenní
regulátory
kmenové buňky
EPITEL TLUSTÉHO STŘEVA (KOLONU)
 druhým nejčastějším nádorem u mužů hned po nádoru plic a u žen po
nádoru prsu
 ČR – vysoká incidence, přední ve statistikách, alarmující růst
rozvoj nádorů kolonu - vlivy genetické
- vlivy zevního prostředí (genotoxická činidla
a negenotoxické promotory)
nerovnováha
proliferace
diferenciace
apoptóza
porušení homeostázy tkáně
karcinom
(kolorektální)
http://cellbio.utmb.edu/microanatomy/digestive/Intestine.htm
NÁDOR TLUSTÉHO STŘEVA
DETEKCE PROLIFERAČNÍ AKTIVITY BUNĚK
Růst buněk
počty buněk (, Coulter Counter, Casy, Bürkerova komůrka) v časových
intervalech od vysetí určitého počtu buněk – růstové křivky
spektrofotometrické stanovení celkových proteinů – Amido black
doba zdvojení populace (doubling time),
generační doba (trvání buněčného cyklu)
Metabolicky aktivní část populace
izotopové metody - stanovení podílu populace syntetizující DNA – inkorporace
3H-tymidinu do DNA – detekce hladiny radioaktivity autoradiograficky nebo
scintilačně – detektor  záření
spektofotometrické metody – inkorporace bromdeoxyuridinu – detekce pomocí
navázáné protilátky – ELISA reader nebo průtoková cytometrie (FCM)
metoda redukce MTT na formazan – založeno na aktivitě mitochondrií
Stanovení mitotického indexu
mikroskopické stanovení podílu buněk v mitóze na řezech z tkání či buněčných
preparátech
TESTY CYTOTOXICITY – KOLORIMETRICKÉ METODY
MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) test
Žluté MTT se mitochondriálními enzymy dýchacího řetězce redukuje na fialový
formazanový derivát, který zůstává uvnitř buněk ve formě nerozpustných
granulí. Po přidání detergentu (lauroylsíran sodný, SDS) a okyselení se
barvivo z buněk uvolní a rozpustí, takže vznikne roztok k fotometrickému
stanovení.
Stanovení viability – vitální barvení trypanovou modří nebo eosinem,
propidium jodid (flow cytometrie) – mrtvé buňky nejsou schopny vyloučit
barvivo a zůstávají obarvené – % živých buněk – viabilita
Dávkové závislosti přežití buněk (detekce IC50)
POČTY BUNĚK
Coulter Counter
Mezi elektrodou uvnitř trubice
a zevní elektrodou protéká
elektrický proud
Buňka procházející mezi elektrodami
přeruší tok proudu a vede k změně
napětí
Změna napětí je úměrná objemu
částice
Změna napětí musí mít určitou
prahovou hodnotu, aby byla
započítána
Suspenze buněk v elektrolytu je
nasávána do trubice s malým
otvorem
CASY
Základní princip stejný jako u Coulter Counter
Navíc analýza
– Viability buněk
– Objemu buněk
– Agregátů
– Debris – „rozbitých buněk“
Růstové křivky (počty buněk v čase)
Koncentrační (dávkové) závislosti
xCELLigence System (Roche)
Real-Time CellAnalyzer
Speciální destičky s mikroelektrodami –
zaznamenávají se změny impedance
Měří tzv. cell index (CI) v reálném čase
(odráží změny v růstu, adhezi, morfologii buněk)
Cell index po působení mastných kyselin
(DHA, NaBt) a jejich kombinace
Linie FHC (lidské fetální střevo)
Linie HCT-116
(adenokarcinom střeva)
DETEKCE BUNĚČNÉ SMRTI
apoptózy/nekrózy/autofagie
Morfologicky – světelný mikroskop
Fluorescenční mikroskop
Průtoková (flow) cytometrie
(TUNEL- barvení konců fragmentů DNA, AnnexinV,
subG0/G1 populace)
Stanovení specifických markerů (proteinů, mRNA)
těchto procesů (western blotting, RT-PCR)
STANOVENÍ APOPTÓZY
více metod principiálně odlišných
Aktivace kaspáz
Kondenzace buňky a organel
Kondenzace chromatinu
Ztráta asymetrie buněčné membrány
Zachování integrity buněčné membrány
Tvorba „bodies“ a jejich fagocytóza okolními
buňkami
Stanovení apoptózy na různých úrovních
procesu… (aktivace kaspáz, uvolnění
cytochromu c, štěpení cílových proteinů, DNA)
MORFOLOGICKÁ DETEKCE APOPTÓZY
barvení DAPI
Během apoptózy – fragmentace
DNA ~ 200 PB
DAPI (4',6-diamidino-2phenylindole)
prochází
neporušenou cytoplazmatickou
membránou
DAPI se vmezeřuje do DNA –
typické „rosety“ pod fluorescenčním
mikroskopem – apoptická tělíska
Absorpční maximum ~358 nm
(ultrafialová)
Emisní maximum ~461 nm (modrá)
http://springerimages.com/Images/Biomedicine/1-10.1007_s13277-010-0036-6-3
http://cytoquant.com/mediac/450_0/media/8cda7dca66452e40ffff84f0ac144225.JPG
DIFERENCIACE
Rozrůznění buněk do odlišných typů (při vývoji,
v dospělosti v některých tkáních – krevní, epiteliální)
Při diferenciaci
se mění morfologie buněk
stoupá aktivita specifických enzymů (např. alkalické
fosfatázy)
stoupá exprese specif. povrchových antigenů
(CD11b, CD 14)
vzniká schopnost fagocytózy a produkce kyslíkových
radikálů (měření redukce NBT nebo
chemiluminiscenčně)
STANOVENÍ DIFERENCIACE BUNĚK
Z ADENOKARCINOMU KOLONU (LINIE HT-29)
Buňky diferencují po působení butyrátu sodného (NaBt, 2–5 mM, 72 h).
Morfologické změny, adheze, zvýšená exprese E-kadherinu,
polymerizace F-aktinu
Zvýšení aktivity alkalické fosfatázy
Metoda fluorimetrického stanovení – přístroj Fluostar (spektrofotometr,
fluorimetr, chemiluminometr).
Spektrofotometrie = stanovování vlastností vzorku, např. koncentrace
určité látky v roztoku, na základě pohlcování světla v různých vlnových
délkách spektra.
APOPTÓZA
% buněk s apoptickou morfologií
(počítá se cca 200 buněk/vzorek)
DIFERENCIACE
Aktivita ALP vyjádřená v %
kontroly (=100%)
PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE
Jedna z hlavních používaných
metodologií.
Měření řady buněčných parametrů
v krátkém čase u 10 tis. buněk.
FACSCalibur
FACSVerse
FACSAria – vysokorychlostní
sorter
FACSCalibur
Mitosis S-phase
Apoptosis
G0G1
G2
Differentiation Senescence
BUNĚČNÝ CYKLUS
DETEKCE POČTU BUNĚK V JEDNOTLIVÝCH
FÁZÍCH BUNĚČNÉHO CYKLU
Flow cytometrie – procento buněk v G0/G1, S a G2/M fázi (propidium iodid)
Stanovení délky fází buněčného cyklu – autoradiografické metody, BrDU
LIPIDOMICKÉ ANALÝZY
(spolupráce s VÚVeL)
změny obsahu jednotlivých typů MK v celkových buněčných lipidech
GC-MS (gas chromatography – mass spectrometry)
2) změny obsahu AA, resp. DHA v jednotlivých skupinách fosfolipidů:
PC, PS, PI, PE, SM a v neutrálních lipidech
LC-MS-MS (high – performance liquid chromatography
– tandem mass spectrometry)
po působení AA, DHA, NaBt a kombinací AA/NaBt, DHA/NaBt)
u buněk FHC a HCT-116
O P
O
O
H2C
CH
H2C
OCR1
O O C
O
R2
OH
H
OH
H
H
OHH
OH
H
O
H OH
phosphatidyl-
inositol
AA
O P
O
O
H2C
CH
H2C
OCR1
O O C
O
R2
OH
H
OH
H
H
OHH
OH
H
O
H OH
phosphatidyl-
inositol
DHA
DOPORUČENÁ LITERATURA:
Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Eds. A. Doyle,
J. B. Griffiths, D. G. Newell, Wiley&Sons Inc., London 1995 (Vol. 1 and 2)
Culture of human tumor cells, Eds. R. Pfagner, R.I. Freshney, Wiley-Liss,
Wiley&Sons Inc., Hoboken, New Jersey, 2004
Current Protocols in Cytometry, Ed. J. P. Robinson et al., Wiley&Sons
Inc., New York 1997
T. Eckschlager a kol.: Průtoková cytometrie v klinické praxi
The Handbook: A guide to fluorescent probes and labeling technologies,
10th edition, R. P. Haugland, Invitrogen Corp. 2005
R. A: Bradshaw, E. A. Dennis: Handbook of Cell Signaling (Vol. 1, 2, 3),
Elsevier Science, Academic Press 2004
Short Protocols in Molecular Biology (Vol. 1, 2) John Wiley &Sons, 2002
K. M. Debatin, S. Fulda: Apoptosis and Cancer Therapy (Vol. 1, 2),
WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. KGaA, Weinheim, 2006
Methods of Enzymology, DNA Microarrays Part A and B, Vol. 410 and 411,
Eds. J.N. Abelson, M.I. Simon, Elsevier Inc. 2006