MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT podzim 2016 KONJUGACE Ivana Mašlaňová iva.maslanova@gmail.com KONJUGACE Přenos DNA zprostředkovaný konjugativními plazmidy Pod pojmem konjugace rozumíme přenos DNA z donorové buňky do recipientní, k němuž dochází po jejich přímém kontaktu. Tento přenos je necitlivý k nukleázám. (Exkonjuganti - v rámci téhož druhu, transkonjuganti - v rámci různých druhů) Přenášené typy elementů (DNA): • Samopřenositelné (self-transmissible) plazmidy • Mobilizovatelné plazmidy • Chromozómová DNA • Konjugativní transpozony (+mobilizovatelné transpozony) transkonjugant (konjugant) KONJUGACE - HISTORIE 1947 - Joshua Lederberg, Edward Tatum - konjugace u E. coli, neznali přesnou podstatu konjugace tlak a podtlak bakterie a+Ď tekuté médium s DNázou Filtrem nemohou procházet bakterie, ale viry a DNA ano Pokus s U-trubicí: důkaz, zda je pro přenos genů nutný kontakt buněk (Davies, 1950) Když se má v novém systému prokázat, že jde o konjugaci, musí se vyloučit alternativní způsoby přenosu, tj. transformace a transdukce. Pro vyloučení transformace se přidá DNáza, pro vyloučení transdukce se k recipientním buňkám přidá filtrát ze suspenze donorových buněk. Proces konjugace se liší u grampozitivních a gramnegativních bakterií. CHARAKTERISTICKÉ RYSY KONJUGACE 1. Jednosměrný přenos plazmidů, jednosměrný/obousměrný přenos chromozómových markerů 2. Je přenášen jen konjugativní plazmid, nebo dochází k mobilizaci dalších elementů (plazmidů, transpozonů, chromozomu) Výskyt konjugace u bakterií G- (enterobakterie) • prototypem je konjugace zprostředkovaná F-plazmidem • řada konjugativních R-plazmidů příbuzných F-plazmidu, mnoho jich má široké rozmezí hostitelů, např. RK2 (RP1, RP4) Další G-: Agrobacterium (Ti-plazmid), Pseudomonas G+ (enterokoky, stafylokoky, streptokoky,streptomycety) • prototypem je konjugace zprostředkovaná pADl • mnoho plazmidů má široké rozmezí hostitelů Konjugace u G- Nejvíce informací bylo získáno studiem přenosu F plazmidu a dalších plazmidů ze skupiny IncF u E. coli. Konjugace u konjugativních plazmidů je zprostředkována geny tra: • tvorba pilusů, na vnější straně buněk, nezbytné pro kontakt donorové a recipientní buňky. Pilusy: flexibilní (ohebné) a neohebné (tuhé) • plazmid tvoří flexibilní pilusy - používá se tekuté medium • neohebné pilusy - používá se pevný podklad • inkubaci přes noc - buňky smyty a přeneseny na selekční medium, kde vyrostou transkonjuganty (exkonjuganty). P donor F- recipient Conjugatlon ©CD F* donor Traniconjugant F* FUNKČNÍ OBLASTI F-PLAZMIDU ?2; I ■j T IS3 O/í™ I Tran sférová oblast G Hl 5 N U V/E R v Bp K E A Y E* C Oblast IS sekvencí TraA - pilin TraQ - transport pilinu TraS, T - zábrana spojení F+ buněk ( TraN,G - stabilizace párů TraY, Z - zlom v oriT TraD - průchod DNA membránou do Vedoucí oblast / n 1 loŕi T ' Dtrcomponent = „DNA transfer and replication" (relaxaza a primaza). M pf component = „mating-pair formation" -vetsina genu Samopřenositelné plasmidy vs. Mobilizovatelné plazmidy FinO imertionally | inactivated ofiT oriS oriV Table Sri Some F plasmid genes and sites Function Protein, site, or antisense RNA Vegetative replication Origin RepFIA/orfV site (RepCr RepE) Origin RepFIB/or/5 site {RepB) Origin RepFIC/inactrvated origin [RepA2r RepL, Inc (RNA), RepAl] Regulation of conjugation RnO, FinP(RNA), Tra| Mating pair formation {Mpf component) TraA, TraB, TraC, TraD, TraE, TraF, TraG, TraH, TraK, TraU TraNr TraP, TraQ TraV, TraW, TraX DNA transfer and replication (Dtr component) cvrTsite, Tral, TraM, TraU, TraY Plasmid SOS inhibition PsiA, PsiB Surface exclusion TraS, TraT Plasmid partitioning Sop A, SopB, sopC site Postsegregatfonal killing SmC (RNA) and SrnB CcdA and CcdB FlmA, FlmC, FlmB(RNA) Exclusion of T7 PifA, PifB Transposon functions ISJa (YaaA, YaaB) Tn 1000 (TnpX, ThpR, TnpA) IS3b (YbfA, YbfB) IS2 {YbhB, YbiA, TbiB) Known function, but unknown relation to conjugation OmpP, Int, ResD, SsB F plazmid 3 počátky replikace: 1. or/V-theta replikace 2. oriS - není nutný pro životaschopnost, přerušen inzercá TnlOOO - stabilizace F plazmidu 3. oriT Oblast tra - dvě komponenty - Dtr a Mpf Dtr: geny pro přenos DNA a replikaci Mpf: geny pro velkou s membránou asociovanou strukturu - pilus TRANSFEROVÁ OBLAST F plazmidu Oblast obsahuje veškerou genetickou informaci nezbytnou pro přenos (33 kb). Asi 60 genů. Geny lze podle funkce rozdělit do 5 skupin: a. Biosyntéza a sestavování F pilusu (traA,B,C,E,F,G,H,L,K,Q,U,V,VV) b. Stabilizace párujících se buněk (traG,N) c. Konjugativní metabolismus (traD,l,M,Y,Z) d. Regulace přenosu (traJ,finO,finP) e. Povrchová exkluze (traS, traT) TraT = vnější membránový protein zabraňující stabilnímu spojení buněk obsahujících plazmidy TraS = protein vnitřní membrány zabraňující vstupu DNA do buňky při náhodném spojení buněk F+ Fenokopie F- = buňky F+, které neexprimují tra geny. Lze je připravit např. hladověním. PRŮBĚH PŘENOSU PLAZMIDOVÉ DNA PŘI KONJUGACI Stádia párování: 1. Donorová buňka naváže kontakt s recipientní pomocí pilusu 2. Následuje přibližování buněk depolymerizací pilusu (retrakce pilusu) 3. Probíhá syntéza plazmidové DNA - chromozom se nereplikuje 4. Dochází k aktivní disagregaci donorových a recipientních buněk ■ F + F F+ F (a) U (d) Typická buňka F+ má asi 20 pilusu - kontakt jedné donorové buňky s několika recipientními._ PRŮBĚH KONJUGATIVNÍHO PŘENOSU DNA Dochází k jednořetězcovému zlomu v oriT v místě nic Odmotávání DNA ve směru 5 "^3' Přenos jednořetězcové DNA 5' koncem do recipienta V donorové buňce je doreplikován komplementární řetězec replikací otáčivou kružnicí V recipientu je komplementární řetězec dosyntetizován diskontinuálně Cirkularizace DNA v recipientu (v případě přenosu plazmidu) Typy pilusů u G- bakterií Rozlišují se flexibilní (ohebné, např. u F plazmidů) a neohebné (tuhé) pilusy (např. plazmid PKM101). Plazmid Collb-P9 - tvorba obou typů pilusů dle prostředí Tip TraT, TraS Povrchová exkluze TraN, TraG Stabilizace párování Tra A (pilin) TraB, TraK - tvoří pór, přichycený k membráně prostřednictvím TraV Lipopoly-saccharides IM!! IIIIH lil Inzerce pilinu do membrány, jeho acetylace 5'konec DNA vázán na tyrozin Tral (relaxáza) RELAXOZOM -adp + p Tra Y, TraM, Tral, IHF el i kazová a relaxázová aktivita (hydrolýza ATP) adp + p, 636999 Sestavování pilu na povrchu buňky Propilin transportován do vnitřní membrány - LepB peptidáza - Pilin - tvorba Pilinového komplexu Dcnur Recipient Mating Pair Format on MPF structure-Formalion a\ mating pairs donorová buňka F+ recipient™ buňka F" Coupling prolein O F-pilusy donorové buňky F' navozuji kontakt s rccipicntními buňkami F~ a přitahuji buňky k sobě. Syntézu konjugačního můstku řídí geny přítomné na F-faktoru. V počátku replikace F-fakloru je jeden řetězec DNA štěpen. O Jeden řetězec F-fakloru je mechanizmem otáčející se kružnice přenášen do recipienlni buňky. Během přenosu probíhá v obou buňkách replikace F-faktoru (v každé buňce je syntetizován jeden řetězec). replikace mechanizmem otáčející se kružnice, ^""N o— o A N replikace 3^ C Q Přenos F-faktoru je dokončen, vznikají dvě bakterie F*. C -l=licas? Relaxase and helicase maka single-strand nick at of iT 3 Relaxase and helicase translocated Id recipienl cel I with DNA ^nmase^^ Coupling protein pumps DNA out of donor cell; relaxase seals nick in recipient cell J Replkalion of second strand completed in donor and recipient cells Separation of mating pair Donorová buňka vytváří pilus, kterým kontaktuje recipientní buňku. (povaha signálu není známa) Dochází k vytvoření póru mezi oběma buňkami Relaxáza aktivovaná „coupling" proteiny vytvoří zlom v oriT na DNA Relaxáza a DNA přecházejí do recipientní buňky, kde relaxáza cirkularizuje DNA Primáza (kódovaná plazmidem nebo chromozomem) zahájí syntézu komplementárního řetězce (tvorba RNA-primeru) Dochází k separaci donorové buňky a transkonjuganta Dcnor Transconjugant INTERAKCE MÍSTA A//CS RELAXÁZOU V MÍSTĚ oriTplazmidu F Oblast oriT (373 bp) Z —r AT + nic (10 bp) t IR, DR Z Rozpoznání místa nic relaxázou (místně specifická endonukleáza) 1 Relaxozom DNA + mob-proteiny Relaxačn í kom plex OriT lze vložit do libovolného plazmidu, který je pak přenesen jako F PŮSOBENÍ RELAXÁZY PŘI PŘENOSU PLAZMIDU KONJUGACÍ Cavalent bond behveen relaxase and DNA Relaxáza vytvoří zlom v místě oriT, 5' fosfát je z DNA přenesen transesterifikační reakcí na tyrozinový zbytek relaxázy TraM protein se váže na ss zlom a rozšíří mezeru na 200 bp ve směru 5-3. Na tuto mezeru se váže protein Tral (helikáza I), která vytváří další rozmotávání za spotřeby ATP. Tak se rozmotá asi 1200 bp. Jednořetězce jsou stabilizovány vazbou SSB proteinů Relaxáza vstupuje do recipientní buňky a vtahuje do ní i jednořetězcovou DNA od 5'konce (T-řetězec) Zpětnou transesterifikační reakcí je fosfát přenesen na 3'OH konec přenesené DNA, čímž se tato recirkularizuje a relaxáza se uvolní Donor Kon jugativ ní přenos F relaxáza- multifunkční komplex T-řetězec ssb-proteiny Rezipient Donor conjugal DNA synthesis (DCDS) - náhradová syntéza DNA v donorové buňce mechanismem otáčející se kružnice Repliconation - syntéza komplementárního řetězce v recipientní buňce -diskontinuálnísyntéza Genetická regulace tra-operonu Je řízena dvěma regulačními okruhy: 1. Produkty genů finO a finP regulují expresi genu traJ negativně 2. Produkt genu traJ reguluje expresi genu traM a traYZ operonu pozitivně. U F plazmidu je gen finO inaktivován IS3a. Produkty genů finO a finP reprimují transkripci genů tra. Zatímco gen finO kóduje protein, exprimuje gen finP krátkou RNA (u F má délku 78 b). Gen finP leží v oblasti genu traJ, je však transkribován v opačné orientaci. Přesný mechanismus zábrany exprese troJ není dosud znám. Pravděpodobně finP-RNA zabraňuje transkripci nebo/a translaci genu troJ. Protein FinO působí buď společně s FinP-RNA, nebo nezávisle na ní. K represi jsou však zapotřebí v každém případě oba produkty. A Genetic organizatioi of íro region TraJ = transkripční aktivátor - protein nutný pro RNA syntézu mRNA oriT írjM tra! -f traX finO Antis€nse RNA E Immediately after entry Into coll A oriT traM ±0 ťnqif Activates pnaY ově vzniklý konjugant přenáší plazmid do dalších buněk s vysokou účinností Pili and transfer funclions I icaY tra* C After plasmld establishment FinP blocks translation: no Tra| Po ustavení plazmidu v buňce se exprimují všechny plazmidové geny a plazmid se přenáší při nízké frekvem oriT íru.Vf tfai traV tra?; finO F nP 1© :irP :inO s-jbilii€s FinP Inhibice fertility finO = negativni regulator — represor fl'nP = negativni regulator — antisense RNA F = drd — derepressed mutant plasmid Charakter buněk F-, F+ a Hfr ZPŮSOBY ZAČLENĚNÍ F PLAZMIDU DO CHROMOZOMU integrace nezávislá na RecA transpozice F-Faktor Chromosom Transposase \ I I IS Element ► oriT V chromozomu přítomnost IS2 a IS3 elementů - možnost homologní rekombinace, frekvence integrace nebo excize 10"4 integrace závislá na RecA homologní rekombinace F-Faktor ' - - Chromosom Ree A-Protein □ IS-Element W oriT v chromozomu se objeví nová IS Vznik kmenů Hfr začleněním F plazmidů do různých míst chromozomu E. coli. Začlenění probíhá v místech IS. a Hfr-Kmenl Hfr-Kmen II Hfr-Kmen lir Hfr-Kmen IV Obr. 64. Mechanismus vzniku různých typů Hfr-kmenů (viz text) Vznik buňky Hfr (HfrH) začleněním F-plazmidu do chromozomu E. coli F+ = Leu+ StrS F- = Leu- StrR Rekombinanty = Leu+ StrR IZOLACE KMENU HFR í n n \ 11 naředěníj -* Leu+StrS o Ozáření suspenze buněk F* U V svěllem 2) Přelivší buňky půdu v takovérr vyrostlo as 30Ckolo se vysejí na kompletní ředění, aby na plotně ni i' >) Na minimální důdu se streptomycinem a> Kolonie buněk F+se přerazítkují sehaočkuje čeriivá kultura F"Leu"Strr na pMnu s nárůstem buněk F" ?VPo 36 hodinách se obě plotny srovnávají Selektivní puda (Minimální půda + streptomycin) Kompletní půda Kolonie buněk Hfr Místa na minimální půdě vyznačující se hustým nárůstem představují rekombinanty Ley*Sirrt které vaníkly konjugací buněk F"s buňkami Hfr přenese-'' nými na plotnu razítkem ^424560416 Křížení kmene F+ a F- RECIPIENT DONOR Suspense buněk F+ ThrWBio"Met"$trs KonjugaČní směs Suspense buněk F~ Thr-Leu"Bio+Met+Strr Roisev na minimalnf Rozsev po 60 minutách Ro2sev na minimální syntetickou půdu konjugace na minimální. syntetickou půdu se strepiomijcinem syntetickou půdu se se streptomycinem streptomycinem i Kolonie rekombinantních transkonjugantij Thr+Leu+Bio+Met+Strr Za vznik rekombinantu jsou zodpovědné buňky Hfr Křížení kmenů F+x F" buňky F -CD 1. V populaci buněk F+je nízká proporce buněk Hfr, v nichž je F plazmid začleněn do různých míst chromozomu 2. Volný F-plazmid se přenáší do F" buněk za vzniku buněk F+ 3. Z buněk Hfr se přenáší část chromozomu do F" buněk za vzniku rekombinant 4. Dochází k superinfekci rekombinant F plazmidem, v důsledku čehož výsledné rekombinanty obsahují F-plazmid Křížení přerušovanou konjugací buňka Hfr H buňka F- U' es« Q 9 minul po zahájení kříženi. Off O 11 minul po zahájení křížení. Q 18 minul po zahájeni kříženi. Charakteristika přenosu: 1. Přenos začíná od oriT na F-plazmidu 2. Chromozomální geny jsou přenášeny v lineárním pořadí od oriT 3. Doba přenosu genů je úměrná jejich vzdálenosti od oriT 4. Pravděpodobnost přenosu genů klesá s jejich vzdáleností od oriT 5. Pravděpodobnost začlenění genů přenesených z donora do chromozomu recipienta je pro všechny přenesené geny stejná *9j Q 25 minul po zahájeni kříženi. Kineťika přenosu markerů při přerušované a nepřerušován konjugaci;.....nepřerušovaná k., přerušovaná k. 10 strS 20 30 40 s.- Cae(v minutách) Po přenosu do recipientní buňky mají všechny geny stejnou pravděpodobnost začlenění do chromozomu (vyjma prvních 1-2') Geny thr a leu přenášené jako první (vysoká pravděpodobnost přenosu) Gen gal a další přenášené později (nízká pravděpodobnost přenosu) Křivky vycházejí ze sledování průběhu konjugace v populaci ga eu thr I I Geny, které se nezačlení Četnost neselektovaných markerů u rekombinant thr+ strR při přerušované konjugaci jako funkce časového intervalu, v němž bylo křížení přerušeno interpretace výsledků počátek přenosu azř tons lac+ gal* o 9 11 18 25 doba přenosu (minuty) (b) Konkrétní přiklad nepřerušované konjugace Křížem: HfrH I^ulProlĽac+GaTTrp+Str5 x F Leu" ProLacGalTrpStr" Selekce jednotlivých kategorií rekombinantů se provede na minimální půdě se streptomycinem a doplněné takto: Donorové a re-cipientní buňky se sm íchaj í, in ku bu jí 60 minut a vysej í na plotny REKOMBINANT! Půda FREKVENCE REKOMBINANTŮ 1. Leu+Stf : + pro, glu, trp 2. Pro+Strr : + leu, glu, try 3. Lac+Strr : + leu, pro, lak, trp 4. Ga^St/ : + leu, pro,gal,trp 5. Trp+Stf : + leu, pro, glu 0,20 0,15 0,13 0,078 0,044 FREKVENCE REKOMBINANTŮ = počet rekombinantů daného typu počet buněk Hfr Odvozené pořadí genů na chromozomu kmene HfrH: O-leu-pro-lac-gal-trp Bakteriální chromozóm X Rekornbinace Excize typu 1 Hxcize iypu II F plazmid typ i F'plazmid — Densíurace iypll Renafurace s F r- riereroduplex se substituční smyčkou F plazmid Vznik plazmidu F' typ I (IA n. IB) - plazmid obsahuje distální nebo proximální část bakteriálního chromozomu typ II - plazmid obsahuje proximální i distální část bakteriálního chromozomu Podíl chromozómové DNA v F'plazmidu může činit až 30% Heieroduplex s deleČnľ smyčkou Vznik plazmidů F' C D Typ IA Typ IB TypII □ IS-Element ► oriT íf TypiB Typ II j jj A 1 J & v chromozomu zůstává část F plazmidů sfa = Sex factor affinity VZNIK F'PLAZMIDÜ HOMOLOGNÍ REKOMBINACÍ MEZI IDENTICKÝMI IS ELEMENTY E coli chromosome E. coli chromosome IS 7 IS2 IS2 IS7 SELEKCE F'PLAZMIDU NA ZÁKLADĚ ČASNÉHO PŘENOSU pozdního MARKERU Parciální diploid Oft) ÖO F' F Pro+ apparent recombinant A. Kmen Hfr přenášející gen pro jako pozdní m arker. Při křížen í s kmenem F- bude gen pro přenášen zhruba po 60 minu tách. B. Vznik F'plazmidu se začleněným genem pro. Při křížení s kmenem F-bude F'pro přenesen během 5 minut. Výsledný zdánlivě rekombinantní kmen bude schopen gen pro dále přenášet při vysoké frekvenci Další možnost: použití recipienta recA" Citliví k fágu M13 VZNIK DRUHOTNÝCH KMENŮ F' Prvotní kmen F' Přenos F'Iac do F Přechod do stavu Hfr (vysoká frekvence) Chová se jako Hfr Heterogenot F'lac/lac Intermediární donor Druhotný kmen F' je diploidní pro alelu přenesenou F'plazmidem V recipientu dochází s vysokou frekvencí k začleňování F'Iac do chromozomu a nebo výměně alely nesené F' (pak záměna alel) Přenos chromozomu ZYGOTICKÁ INDUKCE DNAprofáqa a 1 ^ ,3C pro DNA profága b Chromcaómy Kmene l Hfr H srůinýrn umístěním profága DNA. profáqa c MOBILIZACE Clona pieces randomly into oriT a nonmobiliiable doníng vector Donor Recipienl oriT Transform in:o Dells containing a siclf-trans.miss.iblc plasmid QO) Amp' Cam" Male with recipient; only orrT-oonüining Plasmids are mobilized (Camr 2. Ty Select Ampf LransoonjuganLs- (Amp- ""V azmi Části plazmidu klonovány do nepřenositelného vektoru s vhodným selekčním markerem (Amp). C C Self-transmissible plasmid encodes the MpF system, including a coupling protein Coupling protein signals to relaxase of mobilizabHe plasmid «1^ Nick made at oriTof mobilizable plasmid Mobilizable plasmid transferred Donorová buňka obsahuje dva plazmidy. F plazmid s tra geny -kontakt a přenos; a mobilizovatelný plazmid (modře). mob geny - jednořetězový zlom v oriT Přenos obou plazmidů. Mobilizable plasmid is replicated in the recipient (Q o)(o ) MOBILIZACE NEKONJUGATIVNICH PLAZMIDU DONACI Nedochází k fyzickému kontaktu plazmidů nic = bom basis of mobility 90% C0I+/F+ 5% C0I+/F- Mobilizace prostřednictvím příbuzných plazmidů nic pBR322 Delece ori T pBR327 Mobilizace plazmidů kondukcí - dochází k fyzickému kontaktu obou plazmidů chromozom Přenos kointegrátu Kointegrát DONOR Tvorba konjugačního páru RECIPIENT Rozklad kointegrátu (pX obsahuje transpozon) Dono r Recipient. pX = plazmid nemobilizovatelný donací Salmonella: mají řadu svých plazmidů, často fin+. Po jejich odstranění se do salmonely vnesly F plazmidy. U 5. typhimurium se F včleňuje jen do jednoho místa (místo sfa, jehož původ není znám) Pseudomonas: divergentní skupina druhů a kmenů, má řadu konjugačních systémů, samopřenositelných nebo mobilizovatelných. Plazmid FP2 může mobilizovat chromozom v jednom směru z jediného chromozómového místa. Byly popsány jiné plazmidy mobilizující od jiných míst. Mechanismus mobilizace není znám. KONJUGACE U G+ BAKTERIÍ Konjugační přenos je znám u mnoha rodů: Bacillus, Enterocococus, Lactococcus, Staphylococcus a Streptomyces. Podobně jako u G- bakterií mohou být plazmidy přenášeny i mezi rody a druhy. Plazmidy stejně jako u G- kódují vlastní relaxázu a oriT. Plazmidy kódují geny pro postsegregační usmrcování buněk a partitioning. Kódují virulentní determinanty a geny pro ATB rezistenci, obsahují transpozony. Poskytují selekční výhodu hostitelským buňkám. Hlavní rozdíl v Mpf systému (chybějící vnější membrána u G+). Recipientní buňky produkují feromonům podobné látky - kontakt s donorovou buňkou. FEROMONY = malé peptidy stimulující párování buněk, expresy tra genů Zisk plazmidu vede k zastavení exprese genů pro FEROMONY. ROLE FEROMONŮ V PŘENOSU PLAZMIDŮ C Donor-induced E Donor-unmducBd A. Feromony lokalizované na chromozomu recipienta. Pro-feromony ^ Feromony B. Plazmid donora exprimuje Tra A - represor tra genů kromě traC TraC - povrchový protein citlivý k feromonům Rjecplent cell C. Vazba feromonu na TraC -indukce -feromon se váže na represor Tra A A. Recipientní buňka tvoří feromony: geny pro feromony jsou umístěny na chromozomu. Feromony vznikají odštěpením signálních sekvencí z proferomonů (Pro-cADl) při jejich exportu z buňky. „Quorum sensing". Na povrchu se vytváří binding substance (BS). B. Donorová buňka: nese plazmid exprimující protein Tra A (represor), který reprimuje transkripci tra genů vyjma traC, který kóduje povrchový protein TraC (receptor) zachytávající feromon. D. Přenos plazmidu. Donorová a recipientní buňka navážou kontakt a plazmid se přenese za vzniku transkonjuganta. E. V recipientní buňce (transkonjugantu) se přestává vytvářet zralý feromon. Inhibitorový peptid iADl se váže na TraC a zabraňuje párování dvou donorových buněk. TraB je inhibitorový protein, který brání exkreci feromonu. C. Indukce párování. Feromon se váže na TraC na povrchu donora a vstupuje do buňky, kde se váže na represor TraA, tím jej inaktivuje a navozuje tvorbu TraE, který pak aktivuje expresi tra genů včetně genu asa kódujícího agregační substanci (Asa) Asa - faktor virulence Mechanismy zábrany příjmu homologního plazmidu: Tvorba povrchových proteinů -exkluze vstupu Tvorba peptidů (iADl) zabraňujících vazbě feromonu Tvorba proteinů (TraB) -zábrana úpravy proferomonů a jeho exkrece Model konjugativního přenosu plazmidu u Streptoocccus faecalis Enterococcus (Streptococcus) faecalis Donorová buňka Vazebná substance Vazba na recipientní buňku Geny kódující sex-feromony Regulátorový gen, jehož produkt inaktivuje endogen Regulátorový gen, jehož produkt řídí tvorbu agregační substance >cAD1 adhezin FEROMON Recipientní buňka Feromony = hydrofobní okta- nebo heptapeptidy odvozené úpravami signálních sekvencí lipoproteinových prekurzorů (7-8 aa z C-konce) sex-feromony streptokoků Plazmid Velikost (kb) Feromon pADl 59,6 CAD1 • pOBl 1 71 • C0B1 pPDl - \ 54 CPD1 < pAMyl \ 60 cAH-^1 pAWy2 - 60 cAH-y2 pAHy3 - 60 cAM-v3 pAH373 36 CAH373 pCFlO 54 CCF10 * Jeden kmen muže tvořit více druhu feromonů a získávat tak různé plazmidy. * Plazmidy nesou geny pro tvorbu virulenčních faktorů, bakteriocinů a rezistence k antibiotikům * Plazmidy mohou být přenášeny do jiných druhů bakterií (Staphylococcus) Struktura plazmidů pAD1 (-60 kb) 59.6/0 kb KONJUGACE U STREPTOMYCET B D Development of a streptomycete colony including plasmid mediated conjugation. (A) Streptomycete spores. The chromosome is shown by gold lines. The chromosomes are linear, but the ends may be held together (see Box 1.1). The small dots indicate a conjugative plasmid such as the multicopy plJIOl. (B) Germinating spore. Hyphae begin to form when spores germinate. (C) A growing colony. Growing branching hyphae form so-called "substrate" mycelia. Growing hyphae contain very few cross walls, and so chromosomes (not shown) are not separated into individual compartments. During the transition from panel B to panel C, hyphal fusions may have occurred, allowing an opportunity for recombination between chromosomes from different parents. (D) Sporulat-ing mycelia. The vertically directed "aerial" hyphae have differentiated, forming chains of spores. As shown in panel D', the spores are haploid. A small percentage of the genomes will be recombinant, composed of segments of the different parental chromosomes (recombinants not shown). SPECIFICKÉ RYSY KONJUGATIVNIHO PŘENOSU U STREPTOMYCET D Konjugace nevyžaduje plazmidově-kódované geny pro kontakt buněk (hyf) D Není známo, zda přenos plazmidů nebo chromozómové DNA vyžaduje jednořetězcový zlom, a zda se přenáší jednořetězec D Chromozomy se přenášejí obousměrně, aniž v nich je plazmid začleněn: není pozorován gradient přenosu chromozómových genu D Plazmid pIJlOl kóduje jen jeden Tra-protein, který asi napomáhá přenosu DNA mezi hyfy. Po přenosu se plazmid velmi rychle v hyfech šíří. Letální zygoza - inhibice růstu recipientních buněk, do nichž byl konjugací přenesen plazmid - v okolí kolonie tvořené donorovou buňkou vznikají na nárůstu recipientních buněk poky (pocks) Závěry, které vyplynuly z prvních experimentů 1. Počet rekombinant přibývá s dobou trvání konjugace, lineárně až po dosažení vrcholu. 2. Různé markery jsou jsou přenášeny s různou frekvencí, když byly srovnány stejné doby trvání konjugace. Přenos z Hfr do F- probíhal řízeným způsobem (geny měly své přesné pořadí a přesný čas přenosu). Přenos chromozomu probíhal od pevného místa (ori) orientované) Závěr: pokud probíhá přenos chromozomu konstantní rychlostí, je doba přenosu genů úměrná vzdálenosti mezi nimi. To umožnilo použít minuty jako jednotky genové mapy.