MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT
podzim 2016
Plazmidy
Ivana Mašlaňová
iva.maslanova@gmail.com
Co jsou to plazmidy?
Definice:
Plazmidy jsou extrachromozomální, autonomně se replikující
genetické elementy, které se vyskytují v buňkách všech skupin
mikroorganismů.
Význam:
1. Podstatně ovlivňují základní biologické vlastnosti svých hostitelů, podílejí
se na jejich diverzitě a evoluci.
2. Jsou využívány k poznání základních molekulárně-biologických procesů v
bakteriálních buňkách a horizontálního přenosu genů.
3. Jsou prakticky a široce využívány v metodách MB a GI, zejména jako
vektory.
Charakteristika plazmidů:
- výskyt u bakterií, archeí; dsDNA – kružnicová nebo lineární
topologie; velikost 1 – 1000 kbp, postradatelné pro hostitelskou
buňku, ale význam pro přežití za specifických podmínek (ATB v
prostředí apod.).
Objev:
1946 (Lederberg a Tatum) – objev konjugace u E. coli.
50. léta (Frederiq) – popis plazmidu ColE1, kódující kolicin1 ; objev R-faktorů
(rezistence k ATB)
Ti-plazmidy – vznik nádorů u dvojděložných rostlin
Plazmidy odbourávající sloučeniny těžkých kovů a plazmidy podílející se na
fixaci vzdušného dusíku.
60. léta – plazmidy jako modely molekulárně-biologických procesů (replikace,
rekombinace)
70. léta–současnost – vektory v GI, klonování, sekvenování a mutageneze in
vitro
1 protein s antimikrobiálním účinkem působící na jiné kmeny E. coli
Charakteristika plazmidů u archeí:
• málo prostudované, nejlépe u metanogenních archeí
• většinou kryptické
• některé mají charakter megaplazmidů (např. u Haloferax volcanii) – velikost 690, 442 a
86 kb.
Identifikované geny:
• geny pro tvorbu plynových měchýřků
• geny kódující restrikční endonukleázy a metylázy
• konjugativní plazmidy (r. Sulfolobus) – schopnost integrace do
• chromozomu, jednosměrný přenos, patrně i do bakterií
• některé plazmidy mají geny podobné provirům archeií
1Zillig et al., 1996 http://femsre.oxfordjournals.org/content/18/2-3/225.abstract
Model konjugativního přenosu
plazmidů u Haloferax volcanii1
Lineární plazmidy
Streptomyces rochei – v r. 1979 objev lineární struktury
plazmidu
Další zástupci s lineárními plazmidy:
Borrelia burgdorferi (Lymská nemoc), Nocardia,
Rhodococcus, Thiobacillus
Specifická replikace – chybí primer pro DNA-polymerázu
na 5´konci
- na koncích lineárních plazmidů telomery – kovalentně
spojené konce DNA – podobné strukturám u
eukaryotických virů (Poxviry, Adenoviry)
- plasmid pSLA2 u Streptomyces – proteiny kovalentně
spojené s konci plazmidu – obsah tandemových
obrácených repetic nebo palindromatických sekvencí
(A) Racket frame structure proposed for linear
Streptomyces plasmids. The black circles
represent the terminal protein attached to
the 5’ ends, which is required to protect the
ends and complete the replication of both
plasmid termini. The ovals represent
juxtaposition proteins that bring together
the plasmid termini by binding to specific
regions of palindromic symmetry. The ori
located near the center of the plasmid is
depicted by the box and the arrows indicate
the bidirectional DNA replication from this
ori.
(B) Typical structure of linear plasmids
isolated from Borrelia containing terminal
hairpin telomeric structures composed of
inverted repeats (thick arrows) harboring
the nick sites (vertical arrows) involved in
DNA replication.
Rozdělení plazmidů:
Kryptické - funkce neznámá
Epizomální - reverzibilní integrace do chromozomu hostitele
Konjugativní - schopné přenosu konjugací
Mobilizovatelné - přenositelné za přítomnosti konjugativního plazmidu
Příklady plazmidů:
F-plazmidy (fertilitní faktor, konjugativní)
zodpovědné za konjugaci, příp. mobilizaci jiných plazmidů
R-plazmidy (R-faktory)
zodpovědné za rezistenci k antibiotikům, řada z nich konjugativní
Kolicinogenní (Col-plazmidy) (bakteriocinogenní plazmidy)
Ti-plazmidy (tumory indukující)
Virulentní plazmidy
Plazmidy odbourávající organické sloučeniny (Pseudomonas)
Plazmidy podílející se na fixaci vzdušného dusíku (Rhizobium)
Plazmidy používané jako vektory pro přenos DNA (pBR322, pUC, Ti)
Klasifikace plazmidů:
• označování: pXY123
Univerzální vlastností plazmidů je jejich inkompatibilita, kterou se rozumí neschopnost dvou plazmidů
koexistovat společně v téže buňce(navzájem se vytěsňují).
Kompatibilitou se rozumí schopnost dvou plazmidů koexistovat v jedné buňce bez selekčního tlaku a
stabilně se dědit.
Rozlišuje se mezi vektoriální a symetrickou inkompatibilitou.
• vektoriální: je ztracen vždy jeden konkrétní plazmid ze dvou.
• symetrická: každý z plazmidů je ztrácen při stejné pravděpodobnosti.
Využití inkompatibility při analýze genomu a genů
Do stejné inkompatibilní skupiny náležejí navzájem inkompatibilní plazmidy.
Inkompatibilní plazmidy jsou vzájemně příbuzné (využívají tentýž mechanismus kontroly replikace).
V současné době je známo asi 30 inkompatibilních skupin u enterobaktérií (IntF) , 9 u stafylokoků (Int1 – Int9) atd.
Jak se dá prokázat, že fenotyp buňky je kódován plazmidem?
1. Důkaz přítomnosti plazmidu:
1. Elektroforéza po izolaci plazmidové DNA
2. Průkaz CCC DNA v elektronovém mikroskopu.
3. Centrifugační metody:
Důkaz satelitního pruhu v sacharozovém gradientu;důkaz v CsCl-EB podle konformace CCC, LIN
a OC.
Charakterizace plazmidů
stanovení velikosti: elektronmikroskopicky nebo v agarozovém gelu, kde se
nejdříve linearizuje.
Konstrukce restrikční mapy, sekvenování DNA
Zařazení plazmidu do inkompatibilní skupiny. Za tímto účelem je plazmid přenesen do
vhodných recipientních testovacích kmenů, které již obsahují známé plazmidy příslušných
kompatibilních skupin.
Předpokladem je to, aby oba plazmidy měly různé genetické markery, např. dva různé geny pro
rezistence. Při Inc-testu se kmen pomnožuje nejdříve bez selekčního tlaku 10-50 generací a pak
se vzniklé kolonie testují na přítomnost obou plazmidů.
Pro stanovení příbuznosti dvou plazmidů lze použít i srovnání jejich restrikčních map. Přesnější
analýza určitých oblastí se pak může provést hybridizací. Poslední krok je sekvenování DNA.
Postup: 1. Důkaz přítomnosti plazmidu – 2. Důkaz proteinů kódovaných plazmidem – 3. Ověření (ztráta plazmidu = ztráta daného fenotypu)
1. Průkaz DNA v elektronovém
mikroskopu
2. Centrifugační metody:
důkaz satelitního pruhu po
centrifugaci
3. Elektroforéza DNA v
agarózovém gelu
P
Ch
P
sach.
P
Ch
P
CsCl
(CsCl-EB)
Postup: 1. Důkaz přítomnosti plazmidu – 2. Důkaz proteinů kódovaných plazmidem – 3. Ověření (ztráta plazmidu = ztráta daného fenotypu)
Postup: 1. Důkaz přítomnosti plazmidu – 2. Důkaz proteinů kódovaných plazmidem – 3. Ověření (ztráta plazmidu = ztráta daného fenotypu)
A. Systém využívající minibuňky:
Není přítomen chromozom, ale plazmidy (inkubovány v minimálním mediu za přítomnosti
značených aminokyselin (35S-metionin). Proteiny jsou detekovány na SDS-PAGE a
prokázány autoradiograficky.
Minubuňky = kmeny s mutacemi, vytvařející buňky bez chromozomu s vysokou frekvencí (mutace tvorby septa).
B. Systém využívající maxibuňky:
Po ozáření UV-světlem se chromozomové geny v důsledku poškození neexprimují, většina
plazmidů za těchto podmínek zůstává díky své malé velikosti intaktní a může geny
exprimovat. Důkaz tvorby proteinů probíhá analogicky jako u minibuněk.
C. Systém translace in vitro (Zubayův systém):
Skládá se z testované plazmidové DNA, ze supernatantu po centrifugaci lyzátu buněk E.
coli, obsahujícího proteinové komponenty nutné pro transkripci a translaci (RNApolymeráza,
ribozomy, translační faktory, 19 aminokyselin a jedné aminokyseliny značené,
rNTP, systému regenerujícího energii a další). Důkaz tvorby proteinů probíhá analogicky
jako u minibuněk.
Postup: 1. Důkaz přítomnosti plazmidu – 2. Důkaz proteinů kódovaných plazmidem – 3. Ověření (ztráta plazmidu = ztráta daného fenotypu)
Odstraňování plazmidů(„plasmid CURING“, LÉČENÍ)
A. Interkalační barviva:
Akriflavin, akridinoranž, etidiumbromid a quinarcin patří mezi interkalační barviva, které se
začleňují mezi sousední báze a zabraňují replikaci plazmidů.
B. Coumermycin a novobiocin:
Interference s účinkem DNA-gyrázy, který zavádí negativní superhelikální otáčky do kruhové dsDNA.
C. Rifampicin a mitomycin C:
Rifampicin se váže na RNA polymerázu a zabraňuje tak transkripci. Mitomycin C je metabolicky
aktivován na intermediát, který kroslinkuje DNA řetězce a blokuje tak transkripci.
D. Natriumdodecylsulfát (SDS):
Narušuje vazbu plazmidu k buněčné membráně.
• odstranění plazmidu - ztráta určité vlastnosti buňky – vnesení plazmidu do nového kmene – projev sledovaného fenotypu
Použití látek zabraňujících replikaci plazmidů. Univerzální metodou jsou změny teplo – zvýšení
teploty, skladování kultur v mrazících médiích, vytvoření protoplastů vedoucí k chybné distribuci
replikonů do dceřinných buněk.
Jak se stanovuje počátek replikace (ori) plazmidů?
1. Štěpení plazmidů v různých stadiích replikace
restrikčním enzymem, sledování struktury v EM.
1. Štěpení plazmidu v jednom místě a pozorování v elektronovém mikroskopu.
2. Tvorba minireplikonů – štěpení plazmidu vhodným enzymem na větší počet
fragmentů, přidání selekčního markeru – selekce - pouze fragment s funkčním ori a
selekčním markerem bude životaschopný.
2. Tvorba minireplikonů.
selekční marker
Ampicilin
PODLE POČTU KOPIÍ SE PLAZMIDY DĚLÍ DO TŘÍ SKUPIN
1. S nízkým počtem kopií (1-2/chr)
2. Se středním počtem kopií (asi 15)
3. S vysokým počtem kopií (více jak 15)
(dělení je umělé a hranice není pevná)
When low-copy-number plasmids containing the pMB1 or ColE1 origin of replication are prepared, plasmid
DNA yields can be improved by adding chloramphenicol to the culture medium.Chloramphenicol inhibits
host protein synthesis and thus prevents replication of the host chromosome. Plasmid replication, however,
is independent of newly synthesized proteins and continues for several hours until up to 2000–3000 copies
per cell are accumulated.
Jak se stanovuje počet kopií plazmidu na buňku?
velikost chromozomu (kb)
velikost plazmidu (kb)
radioaktivita plazmidu (cpm)
radioaktivita chromozomu (cpm)
xPOČET KOPIÍ =
Ultracentrifugace v CsCl-EB s radioaktivně značenou DNA, stanovení radioaktivity v jednotlivých frakcích (pruzích).
Elektroforéza v gelu, stanovení množství DNA (densitometricky).
cpm = počet rozpadů za minutu
A: Ultracentrifugace s radioaktivně značenou DNA
B: Kvantitativní PCR (qPCR)
POČET KOPIÍ =
velikost chromozomální DNA bp × množství plazmidové DNA [pg]
velikost plazmidové DNA bp × množství chromozomální DNA [pg]
Plasmid copy number in bacterial cell
y = -3,5463x + 28,839
R2
= 0,9997
y = -3,4435x + 27,971
R2
= 0,9992
0
5
10
15
20
25
30
35
-2 -1 0 1 2 3 4 5
log c [pg]
Ct
plasmid DNA- gene blaZ
genomic DNA - gene mecA
Regression line of genomic DNA (gene mecA)
Regression line of plasmid DNA (gene blaZ)
Quantitative real-time polymerase chain reaction for
determination of plasmid copy number in bacteria (Chai Lian
Lee et al,2006)
STANOVENÍ ČETNOSTI REPLIKACE PLAZMIDŮ
CENTRIFUGACÍ V GRADIENTU CsCl
15N 14N/15N 14N
Plazmid, který se replikoval
dvakrát nebo vícekrát
Plazmid, který se nereplikoval
Plazmid, který se replikoval 1x
0,3 generace
0,5 generace
1,0 generace
Růst buněk v mediu s 14N a
následně v mediu s 15N
Jak se plazmidy replikují?
Replikace plazmidů souvisí s inkompatibilitou – soutěžení o replikační aparát (využití
replikačního aparátu hostitelské buňky)-vyředění některého plazmidu ze stejné
inkompatibilní skupiny.
Začíná ve specifickém místě (oriV)(n. oriT) vytvořením volné 3´OH skupiny (buď RNA
primer, nebo zlom DNA).
malé plazmidy – mechanismus otáčivé kružnice (RC – plazmidy)
velké plazmidy – theta mechanismus – obousměrná replikace, podoba s replikací
chromozomu
Rep protein a další proteiny hostitele (DnaA, B, G aj.), v místě ori je po vazbě
iniciačních faktorů syntetizována primerová-RNA (plazmidy typu ColE1 nevyžadují
pro tvorbu primerové-RNA žádný protein kódovaný plazmidem).
STRATEGIE KONTROLY POČTU
PLAZMIDOVÝCH KOPIÍ
Inhibitor – cíl
Plazmid kóduje difuzibilní inhibitor replikace, který se váže na
cílovou sekvenci
Přímá regulace
Vazba inhibitoru
brání iniciaci replikace
Nepřímá regulace
Vazba inhibitoru brání
syntéze produktu nezbytného
pro zahájení replikace
Iteronová strategie
Regulační protein (Rep) nezbytný k zahájení replikace je vázán
(titrován) opakujícími se sekvencemi (iterony) poblíž ori.
Replikace nastává po nasyntetizování dostatečného množství
volného regulačního proteinu.
REGULACE REPLIKACE
ColE1 PLAZMIDU
A JEHO DERIVÁTŮ
Preprimer = cíl inhibitor
„Kissing“
komplex
Párování RNAI
a pRNA-
prekurzoru
(RNAII)
zabraňuje
maturaci
primerového
transkriptu
Rop (regulation of
primer)
Rom (RNA One
inhibition Moderator).
inhibitor
„hug“
oriV – denaturace DNA, syntéza
řetězců od primerů
Primer – vznik z pre-primeruprekurzorová
RNA (RNAII, 500-
550 bp) – syntetizovaná RNA
polymerázou.
3OH´přesahuje ori – úprava na
primer RNázou H (enzym
kódovaný hostitelem) – 3´OH
konec do počátku replikace –
vytváření komplementárního
řetězce.
Regulace – RNAI vs. RNAII –
antisense – vazba RNAI na
preprimer RNAII – brání úpravě
3´OH konce RNázouH – replikace
neprobíhá.
Rop dimer – negativní regulátor –
Kissing komplex.
Kontrola počtu plazmidů:
1. Počet ori na buňku.
2. Hladina regulačních proteinů.
Po spárování RNAI a RNAII
se změní sekundární
struktura RNAII
(preprimeru), který pak není
RNázouH upraven na primer
+ Rop
Mutace v genu
rop vedou ke
zvýšení počtu
kopií plazmidu
INTERAKCE RNAI S RNAII PŘI
INCIACI REPLIKACE ColE1
ori V
Interakce RNAI, RNAII
a proteinu Rom (~Rop)
při iniciaci replikace
ColE1 plazmidu.
Mutace v genu pro
protein Rop vedou ke
změně počtu plazmidových
kopií.
REGULACE REPLIKACE R1 PLAZMIDU A JEHO DERIVÁTŮ
• Regulace počtu kopií plazmidu pomocí množství
Rep proteinu.
• Jako u ColE1 plasmid využívá malé
komplementární RNA, stejně tak tvoří tzv. kissing
komplex.
• Rozdíl od ColE1:
• Komplementární RNA molekuly inhibují
tvorbu Rep proteinu nikoli primeru (ColE1) –
mRNA kódující Rep se nepřekládá.
Jakmile plazmid vstoupí do buňky, je většina RepA mRNA
vytvářena z promotoru PrepA. Protein RepA se tvoří tak
dlouho, dokud není dosaženo standardního počtu kopií.
Jakmile plazmid dosáhne žádaného počtu kopií, protein
CopB reprimuje transkripci z promotorou PrepA. Nyní je
repA transkribován jen z PcopB.
Antisense RNA CopA hybridizuje k oblasti mRNA kódující
vedoucí peptid a dsRNA je je štěpena RNázouIII. To
zabrání translaci repA, která je translačně spojena s
vedoucím peptidem.
Vazba Inc antisense RNA na smyčku struktury I
přímo inhibuje vytvoření pseudoknotu, a
následně duplex IncRNA-mRNA inhibuje translaci
RepY, a následně i translaci RepZ, jelikož jsou
translačně spojeny.
REGULACE REPLIKACE ColIb-P9 PLAZMIDU A JEHO DERIVÁTŮ
Podobně jako u R1 plazmidu je gen kodující
protein Rep (zde je to repZ) translatován po směru
transkripce od ORF vedoucího peptidu zvaného
repY a tyto dva jsou rovněž translačně napojeny.
Translace repY otevírá sekundární strukturu na
RNA, která uzavírá SD sekvenci TIR (translační
iniciační oblast genu repZ). Sekvence v sekundární
struktuře se pak může párovat se smyčkou
upstreamové vlásenky od genu repY vytvářející
pseudoknot (smyčku), čímž permanentně ruší
sekundární strukturu a ponechává SD genu repZ
přístupnou.
Pak se na TIR genu repZ může navázat ribozom a
překládat iniciátorový protein.
Malá komplementární Inc RNA se páruje se
smyčkou upstreamové vlásenky a zabraňuje
vytvoření vlásenky, ponechávajíc SD sekvenci
kodující oblasti repZ blokovanou a zabraňující
translaci repY.
KONTROLA REPLIKACE ITERONOVÝCH PLAZMIDŮ
Plazmid kóduje difuzibilní iniciační protein Rep, který se váže na řadu 17-22 bp
dlouhých přímých opakování (3-7 kopií) - iteronů - v oblasti oriV (různý počet u
různých plazmidů).
RepA protein kódovaný v oblasti ori má následující vlastnosti:
- iniciuje nové cykly replikace
- může zabraňovat replikaci
- autorepresor na úrovni transkripce
Působení Rep je závislé na jeho koncentraci, která je ovlivňována počtem
plazmidových kopií (a tím i počtem iteronů) a rozdílnou afinitou Rep k iteronům
(L a R) v oblasti ori.
Iteronové plazmidy příklady:
pSC101, F, R6K, P1 a RK2 příbuzné plazmidy
Jak to funguje?
R = CAAAGGTCTAGCAGCAGAATT-(TACAGA-R3)
RepA
aktivace
replikace
Vazba DnaA a
dalších proteinů
kódovaných
chromozomem.
autoreprese
RepA – pozitivní aktivátor replikace
• Vazba na R1, R2, R3 = regulace počtu
kopií.
• Hostitelský chromozom kóduje další
proteiny vázající se na tuto oblast a
iniciující replikaci: DnaA-G.
• Dva mechanismy regulace:
1. Kontrola syntézy RepA
2. Represe transkripce genu repA
Vyšší koncentrace RepA = represe syntézy proteinu = autoregulace transkripce.
Tento mechanismus ale sám nestačí pro kontrolu počtu plazmidových kopií v buňce =
„Coupling“ hypotéza
R = CAAAGGTCTAGCAGCAGAATT-(TACAGA-R3)
RepA
PŮSOBENÍ PROTEINU RepA NA INICIACI REPLIKACE U ITERONOVÉHO
PLAZMIDU pSC101
aktivace
replikace
autoreprese
Vazba DnaA a
dalších proteinů
kódovaných
chromozomem.
nízká koncentrace RepA replikace; vysoká koncentrace RepA autoreprese
iterony
KONTROLA REGULACE INICIACE REPLIKACE PLAZMIDU F
čtyři L-iterony pět R-iteronů
rep
Rep
Silnější vazba Rep
iniciace replikace
při nízkých
koncentracích Rep
Slabší vazba Rep
zábrana replikace při
vyšších
koncentracích Rep
Experimentální pozorování: delece R-iteronů vede ke zvýšení a
adice dodatečných R-iteronů ke snížení počtu kopií.
„coupling“ model
(spojení plazmidů)
DVOJÍ PŮSOBENÍ RepA PROTEINU ITERONOVÝCH PLAZMIDŮ
Nízký počet
plazmidových kopií
v buňce
RepA se váže jen na
jeden plazmid a iniciuje
replikaci.
Vysoký počet
plazmidových kopií v buňce
RepA se váže na dva
plazmidy současně a
spojuje je, čímž brání
replikaci.
Důkaz EM
MECHANISMY ZAJIŠŤUJÍCÍ STABILNÍ UDRŽENÍ PLAZMIDŮ V
BUŇKÁCH (SEGREGAČNÍ STABILITA PLAZMIDŮ)
U vícekopiových plazmidů (>20) typu ColE1 je přítomen nekódující úsek (cer,
380 bp), který je cílem působení místně specifické rekombinázy (kódovaná geny
xerC a xerD na chromozomu) – „Multimer resolution systems“
• u větších plazmidů jsou rekombinázy kódovány plazmidovými geny
• u nízkokopiových plazmidů jsou přítomny aktivní mechanismy rozdělování:
• aktivní segregace: partitioning (lokus inc + proteiny Par(Sop))
• postsegregační usmrcování buněk, které ztratily plazmid (interakce
stabilního toxinu s nestabilním antitoxinem)
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
SYSTÉM PRO ROZDĚLOVÁNÍ MULTIMERNÍCH
PLAZMIDOVÝCH FOREM
Resolváza
(místně specifická rekombináza)
Přímá opakování
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
Xer FUNKCE E. coli KATALYZUJE MÍSTNĚ-SPECIFICKOU
REKOMBINACI V MÍSTECH CER PRO ROZKLAD PLAZMIDŮ
Proteiny XerC
a XerD E.coli
Působí na místo
Dif poblíž ter na
chromozomu u
E. coli
ColE1
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
Plazmidové dimery –
výsledkem chybného
ukončení replikace nebo
rekombinace monomerů
ZAJIŠTĚNÍ POČTU KOPIÍ SYSTÉMEM CER A XER
Plazmid obsahuje cer
vysoká pravděpodobnost vzniku bezplazmidových buněk
nízká pravděpodobnost vzniku bezplazmidových buněk
Plazmid neobsahuje cer
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
• Plazmid – geny kódující speciální proteiny, nekódující
sekvence pro přichycení na membránu = proteiny kódujících
oblastí interagují s nekódujícími sekvencemi; kódují spec.
ATPázy pro rozdělení kopií
• Buňka – místo par na membráně sloužící k přichycení
plazmidů
Protein (Par) na plazmidu se váže na místo par na membráně.
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
MODEL AKTIVNÍ SEGREKACE (nízkokopiové plazmidy)
ParS
MODEL PŮSOBENÍ FUNKCE SOP (PAR) U F PLAZMIDU
zajištění distribuce plazmidových kopií do dceřiných buněk
sopA kóduje protein, který zřejmě reguluje expresi sopB:
Protein SopB se váže spolu s proteiny hostitele na lokus sopC (místo parS) obsahující
12 tandemových 43 bp-repetic a je ukotven na vnitřní membránu.
3 kb
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
Sop = stability of plasmid
Par = partitioning (rozdělování)
Proteiny hostitele
Vnitřní membrána
MODEL ROZDĚLOVÁNÍ PLAZMIDU R1
A. Struktura lokusu par: lokalizace genů parM a parR a cis-působícího místa
parC.
B. ParR se váže na místo parC, což umožňuje navázání ParM-ATP.
Filamentum se prodlužuje nasedáním dalších podjednotek ParMATP,
což vede k pohybu plazmidových kopií k pólům buňky.
Filamentum je destabilizováno, jakmile dojde k hydrolýze ParMATP
na ParM-ADP.
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
INTRACELULÁRNÍ LOKALIZACE PLAZMIDŮ
Metoda: využití fluorescenčního značení proteinů vázajících se na sekvence plazmidů
1. Plazmidy mají v buňkách specifickou nebo preferovanou lokalizaci: obvykle poblíž
první a třetí čtvrtiny buňky.
2. Lokalizace plazmidu v buňce závisí na jeho rozdělovacím systému.
3. U rychle rostoucích buněk jsou plazmidy ve dvojicích nebo skupinách, které využívají
společné připojovací místo na membráně (počet fluorescenčních signálů je nižší než
počet plazmidových kopií).
4. Různé typy (druhy) plazmidů využívají různá místa pro přichycení při jejich dělení a v
buňce se nacházejí na různých místech.
Celkový závěr:
Platí obecný model, podle kterého je signál pro rozdělení plazmidu u dělících se buněk
uprostřed a po rozdělení buňky se přesunuje do první a třetí čtvrtiny buňky.
Shrnutí:
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
Nově zreplikované plazmidy umístěné
ve středu buňky se oddělí a přesunou
do první a třetí čtvrtiny ještě před
tvorbou septa.
Po rozdělení buňky se tyto polohy
stávají v dceřiných buňkách opět
středovými.
OBECNÉ SCHÉMA ZNÁZORŇUJÍCÍ ROZDĚLOVÁNÍ PLAZMIDŮ
Rozdělovací aparát
(jeho složky nejsou
dosud známy)
MODELY ZNÁZORŇUJÍCÍ FUNKCI MÍST PAR U PLAZMIDŮ F A RP1
A. Plazmid se váže na místo par
na membráně. Při dělení buňky
jsou kopie plazmidu přichyceny
na rozdělená místa par a taženy
do dceřinných buněk
B. Dvě kopie plazmidu se nejdříve
navážou na místo par a při jeho
rozdělení jsou odděleny
Fluorescenčně značené
proteiny Par (ParA-GFP;
ParB-GFP)
Vizualizace polohy plazmidů F a P1 uvnitř buněk E. coli
pomocí fluorescenčního barvení – různé plazmidy se
nacházejí v různých místech
F - červená
P1 - zelená
Membrána
- modrá
OBECNÝ MECHANISMUS „GENETICKÉHO DONUCOVÁNÍ“
(závislosti, addiction systems) – udržování plazmidu v populaci buněk
Plazmid je
přítomen,antitoxin
inhibuje toxin,
buňka přežívá
Plazmid není
přítomen, toxin usmrtí
buňku
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
Na plazmidu jsou přítomny dva geny, kódující dva produkty:
1. toxin (killer) - stabilnější
2. antitoxin (antidot, antikiller) - nestabilní
Toxin: napadá životně důležité molekuly v buňce
Antitoxin: eliminuje působení toxinu
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
Ccd = couples cell division (geny týkající se buněčného dělení - replikace DNA )
Odbourá antitoxin po ztrátě plazmidu
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
+++ +
operon
nefunkční antitoxin
Degradace antitoxinu proteázou
Smrt
buňky
POSTSEGREGAČNÍ USMRCOVÁNÍ BEZPLAZMIDOVÝCH
BUNĚK PŮSOBENÍM PROTEINOVÝCH SYSTÉMŮ
funkční antitoxin
Negativní
regulace
- v nadbytku
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
SLOŽKY PROTEINOVÝCH SYSTÉMŮPRO UDRŽENÍ PLAZMIDU V BUŇCE
Proteiny pro replikaci chromozomu buňky
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
RM-systémy typu II nesené na plazmidu (např. EcoRI)
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
C. Anti-sense-RNA-regulated systems
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
POSTSEGREGAČNÍ ZABÍJENÍ BEZPLAZMIDOVÝCH BUNĚK
PŮSOBENÍM SYSTÉMU HOK/SOK U PLAZMIDU R1
Antisense sok-RNA je
nestabilní a po ztrátě
plazmidu z buněk rychle
zmizí
hok = host killing (toxin); sok = suppression of killing (antitoxin)
Hok protein je stabilní a po
ztrátě plazmidu z buněk
navodí kolaps
membránového potenciálu
1. místně specifická rekombináza – 2. partitioning – 3. systém toxin-antitoxin
(geny pro přenos a replikaci, + TetR)
RTF
Vystavením buněk antibiotiku dochází k amplifikaci R-složky a zvětšuje se velikost
celého plazmidu.
R determinanta
(geny pro rezistence)
R plazmid
SLOŽKY R-PLAZMIDŮ
1. Resistance transfer factor (RTF) – nese geny regulující DNA
replikaci a počet kopií, geny pro přenos a někdy geny pro rezistenci k
tetracyklinu.
2. R determinanta – má různou velikost a nese další geny pro
rezistenci k antibiotikům – obvykle ampicilinu, chloramfenikolu,
streptomycinu, kanamycinu, sulfonamidu – v různých kombinacích.
IS element
+
R-plazmidy
ÚLOHA TRANSPOZONŮ PŘI EVOLUCI R-PLAZMIDŮ
každý transpozon může být přenášen nezávisle
Segment obsahující transpozony
nesoucí determinanty rezistence
Segment pro přenos determinant
Bakteriociny inhibují jednu nebo více základních funkcí
(replikace, transkripce nebo translace, nebo energetický
metabolismus).
Na nárůstu citlivých buněk vytvářejí sterilní zóny – lakuny.
Pravé koliciny x defektní fágové částice (fágové bičíky, lytické
enzymy)
PŘÍKLADY BAKTERIÁLNÍCH DRUHŮ PRODUKUJÍCÍCH BAKTERIOCINY
KOLICINOGENNÍ PLAZMIDY
– PRODUKUJÍ LÁTKY S ANTIBIOTICKÝCH CHARAKTEREM
PLASMID ColE1
• 6646 bp velký plasmid, kódující koliciny –
bakteriocinogenní plazmid
Koliciny – proteiny s antibiotikovým účinkem, půsocí na jiné
kmeny E. coli, detekce podobná jako citlivost k fágům – tvoří
lakuny podobně jako plaky u fágů
- Koliciny se váží na povrchové receptory na buněčných
stěnách, produkce kolicinů indukovaná faktory
poškozujícími DNA
- Koliciny jsou inaktivní vzhledem k buňkám, kt. obsahují
kolicin = imunita
Struktura plazmidu:
• pRNAII – promotor pro primer RNAII
• oriV – počátek replikace
• inc – kóduje RNAI
• bom
• cea – oblast kódující kolicin
• mob – oblast pro mobilizaci
• rop – protein pro regulaci počtu kopií
STRUKTURA F PLAZMIDU (100 kb, 49% GC)
60 genů rozdělených podle funkce do 5 oblastí
1. Tranferová oblast
33 kb, 31 genů všechny funkce nezbytné pro přenos.
Biosyntéza a sestavování F pilu (traA,B,C,E,F,G,H,L,K,Q,U,V,W)
Stabilizace párujících se buněk (traG,N)
Konjugativní metabolismus DNA (traD,I,M,Y,Z)
Regulace přenostu (traJ,finO,finP)
Povrchová exkluze (traS,T)
2. Vedoucí oblast
Oblast, která je při přenosu DNA přenášena
jako první. 13 kb.
3. Oblast replikace
Tři oblasti s geny a sekvencemi
podílejícími se na replikaci.
4. Oblast s inzerčními sekvencemi
(IS3a,b, IS2, Tn1000)
5. Pif oblast
Pif (phage inhibition by F). Tři geny pifC.
HLAVNÍ FUNKČNÍ OBLASTI F-PLAZMIDU
1. Transferová oblast
2. Vedoucí oblast
3. Oblast replikace
4. Oblast s IS sekvencemi
5. Pif oblast
Transferová oblast
CHARAKTERISTIKA Ti-PLAZMIDŮ
(tumory indukující; 150-200 kb)
Hostitel:
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rubi
Agrobacterium rhizogenes (Ri-plazmidy)
Ti – způsobuje krčkové nádory (crown galls)
Ri – způsobuje vlasaté kořeny (hairy roots)
Geny na plazmidu:
T-DNA (15-45 kb) – syntéza opinů a fytohormonů
Geny pro virulenci
Geny pro katabolismus opinů
Ori
Geny pro konjugaci
Typy Ti-plazmidů (podle typu opinu)
nopalinový
oktopinový
agropinový
sukcinamopionový
Typy Ri-plazmidů
manopinový
agropinový
Agrobacterium tumefaciens G-
Struktura opinů
1. Rodina oktopinů
Vznik kondenzací pyruvátu s některou aminokyselinou:
-
-
-
Pyruvát
+ arginin: oktopin
Pyruvát + lyzin: lyzopin
Pyruvát + histidin: histopin
Pyruvát + ornitin: kys. oktopinová
2. Rodina nopalinů
Vznik kondenzací a-ketoglutarátu s aminokyselinami
3. Rodina agropinů
Vznik kondenzací kys. glutamové s aminokyselinami
CHEMICKÁ STRUKTURA OPINŮ (zdroj C, příp. N)
Aminokyselina + Pyruvát Pyruvát
• jeden z nejvýznamnějších metabolitů, vznik v závěrečné
fázi glykolýzy, z jedné molekuly glukózy vznikají 2
molekuly pyruvátu.
• je metabolitem alkoholového i mléčného kvašení,
transaminací přechází na alanin, je konečným produktem
katabolismu uhlíkového řetězce cysteinu, serinu, glycinu,
treoninu a hydroxyprolinu.
• enzymatickou reakcí je metabolizován na kyselinu
oxaloctovou nebo na acetyl-CoA (substráty Krebsova
cyklu, který tvoří „palivo“ buňky).
Pyruvát
L-arginin
oktopin-dehydrogenáza Octopine
Transformace rostlin navozená Ti-plazmidem Agr. tumefaciens
1. Poraněná rostlina
3. Přenos T-DNA do rostlinné buňky
4. Začlenění T-DNA do jádra rostlinné buňky
opiny
5. Vytvoření krčkového nádoru
fytohormony
2. Infekce rostliny bakterií s Ti-plazmidem
T-DNA
Struktura Ti-plazmidu A. tumefaciens
Část plazmidu
přenášená do rostliny.
Geny pro
katabolismus
opinů.
Geny zodpovědné
za tvorbu opinů v
rostlinných buňkách.
25 bp RB - sekvence nezbytná pro
začlenění T-DNA do genomu rostliny.
Geny zodpovědné
za transformaci
rostlinných pletiv.
Geny pro přenos
T-DNA do
rostlinných buněk.
25 bp LB
MOZAIKOVITÁ STRUKTURA Ti-PLAZMIDU
Konjugativní přenos
Ti-plazmidu do
bakterií
Přenos mezi
bakteriemi
PRŮBĚH PŘENOSU Ti-PLAZMIDU DO ROSTLINNÉ BUŇKY
1. Poranění rostliny, sekrece fenolických látek do
prostředí (typu acetosyringonu: acetovanilon,
hydroxyacetofenon aj.)
2. Reakce bakterií A. tuefaciens na fenolické látky
(pozitivní chemotaxe)
• Aktivace genů vir na Ti-plazmidu; připojení bakterií k
rostlinným buňkám (spolupůsobenní chr. genů chvA,
chvB, pscA)
3. Aktivace transkripce genů virB, C, D a E prostřednictvím
proteinu kódovaného genem virG.
4. Působení produktů genů vir:
• vznik jednovláknových zlomů na Ti-plazmidu (produkt
genu virD) + tvorba jednovláknových kopií T-DNA
5. Vytvoření přenosového komplexu T-DNA a
polypeptidů virD a virE
6. Přenos komplexu T-DNA do rostlinné buňky
7. Přenos T-DNA do jádra rostlinné buňky
8. Integrace T-DNA do chromozomu (různá místa, částečná
homologie sekvencí RB a LB s místy začlenění)
FUNKCE PLAZMIDOVÝCH GENŮ VIRULENCE
Geny vir = skupina genů v úseku asi 35 kb, velmi podobném u různých Ti-plazmidů.
Celkem asi 25 vir genů (7 operonů): virA,B,C,D,E a G, vytvářejících 20 polypeptidů.
Funkce genů vir:
a)tvorba jednovláknových zlomů na T-DNA: virD1, virD2
b)odkrucování jednovláknové T-DNA: virD1, virD2 a virE2
c)vytvoření přenosového komplexu T- DNA/proteiny: virD1, virD2 (virB)
d)rozmezí hostitelů: virC
Ti-plazmid - shrnutí
HLAVNÍ RYSY PŘENOSU T-DNA DO ROSTLINNÉ BUŇKY
1. Do rostlinné buňky je z Ti-plazmidu přenášena pouze T-DNA, ve formě ssDNA.
2. Při integraci T-DNA do rostlinného genomu dojde k definovanému začlenění 5´ konce (1-2 bp BR),
začlenění 3´ konce je variabilní (vznik delecí 3-100 bp).
3. Do rostlinného genomu se může začlenit více kopií T-DNA, i tandemově (vznik tandemů není
jasný).
4. Pro přenos je nutná pouze 25 bp RB.
5. Místo integrace je náhodné, nejsou vyžadovány úseky homologie – preferenčně probíhá do
transkripčně aktivních oblastí (často místa bohatá na AT páry).
6. Vlastní proces integrace T-DNA do genomu rostliny není jasný – účast reparačních enzymů
rostliny? Nebo produkty genů na T-DNA.
7. V místě integrace dochází k přeskupením (delece, přeskupení apod.).
Symbiotické plazmidy Rhizobiaceae (pSyn)
Diazotrofie: klíčový proces v biosféře – přeměna N2 na redukované formy (amonium)
- volně žijící bakterie uskutečňují tento proces pro svou potřebu při omezeném
množství amoniaku nebo nitrátů
- symbiotické mohou fixovat dusík jen po vytvoření mutualistických interakcí
s leguminózami
Předpoklady pro ustavení účinné symbiozy mezi bakteriemi a rostlinou:
- chemotaktická invaze bakterií do kořenových buněk, kde se vytvoří specializovaný
rostlinný orgán: nodula
- bakterie mají 20 různých nodulačních (nod) genů – ty se podílejí na syntéze nebo
sekreci nodulačních faktorů (= silné mitogeny, přetvářející rostlinné buňky)
- uvnitř rostlinných buněk vytvářejí bakterie bakteroidy, což jsou specializované buňky
určené k fixaci dusíku. Bakteroidy dodávají rostlině fixovaný dusík a od rostliny
odebírají fotosyntézou vytvářený uhlík.
Bakterie příbuzné rhizobiím byly zjištěny i u mravenců ve specializovaném orgánu pro
recyklování dusíku.
Lokalizace symbiotických genů u rhizobií
- Symbiotická fixace dusíku vyžaduje asi 60 genů
- Geny pro symbiozu jsou na 150 kb až 1683 kb plazmidech
(megaplazmidy), které představují 25-50% velikosti genomu
- většina genů pro nodulaci a fixaci dusíku je na jediném
symbiotickém plazmidu pSyn, v některých případech na
konjugativním transpozonu (502 kb) – symbiotický ostrov
- ztráta plazmidu vede k neschopnosti fixovat dusík
- Evoluce: přenos plazmidů nebo ostrovů vede k novým druhům
Degradativní plazmidy
Nesou geny propůjčující bakteriím schopnost biologicky degradovat organické sloučeniny, které se
běžně v přírodě nevyskytují. Ve většině případů kódují část degradační dráhy včetně regulačních
elementů.
.Pseudomonas:
salicylát, naftalen, kafr, octan, toluen, fenoly, xylen, dichlorfenoxyaceton,
chlorbenzen.
TOL plazmidy (prototyp degradativních plazmidů)
Plazmidy nesou geny pro degradaci toluenu, xylenu, benzylalkoholů,
benzylaldehydů
Příbuzné plazmidy: schopnost růst na salicylátu nebo naftalenu jako jediném
zdroji C a E.
2,4-D-plazmid = model pro studium degradace chlorovaných aromatických
látek (např. (2,4-D = dichlorfenoxyoctové kyseliny používané jako herbicid)
Obecné rysy virulenčních plazmidů enterobakterií
- velikost 60-200 kb, nízkokopiové (1-2 kopie)
- podobné buď F plazmidu nebo R100
- v jedné buňce může být i více různých virulenčních plazmidů
- např. Yersinia má tři různé plazmidy, z nichž každý přispívá
výrazně k virulenci
Virulenční plazmidy
• nesou geny zodpovědné za patogenitu a virulenci bakteriálních kmenů
buňka schopná pohlcovat drobné cizorodé částice, např. bakterie.
Geny virulence na plazmidech
Faktory virulence pro kolonizaci buněk a tkání
- toxiny pro adhezi na epitel a invazi,
- tvorba biofilmu
- průnik bakterií buněčnou membránou hostitele,
- systemické šíření do dalších tkání
- intracelulární přežívání v mikrofágách.
Virulenční geny obecně zvyšují přežívání v hostiteli, adherenci a invazivitu
do buněk a někdy interferují s imunitními funkcemi hostitele
Mikrofág, též neutrofilní granulocyt, druh bílé krvinky, leukocyt – fagocytující
Virulenční plazmidy gramnegativních bakterií
Výskyt: Čeleď Enterobacteriace
A. Normální mikroflóra gastronintestinálního traktu člověka Enterobacter, Klebsiella, Escherichia
B. Patogeny: Salmonella, Shigella, Yersinia
Patogenní kmeny Escherichia coli:
Enterotoxigenní (ETEC)
Enteroinvazivní (EIEC)
Enterohemorhagické (EHEC)
Enteropatogenní (EPEC)
Enteroagregativní (EaggEC)
Spektrum chorob odráží obsah genů virulence lokalizovaných na plazmidech, bakteriofágách,
ostrovech patogenity (PAI), které nejsou u komensálů.
Virulenční plazmidy nesporulujících G+ patogenů
G+ bakterie: nejzávažnější nosokomiální patogeny jsou stafylokoky a enterokoky
Řada z nich je multirezistentní k antibiotikům.
Virulenční plazmidy Staphylococcus aureus
Extracelulární proteiny: toxiny vázané k určitým typům chorob
Enterotoxiny - ETB: potravinové otravy, TSST – syndrom toxického šoku, exfoliatin – syndrom opařené kůže
Virulenční plazmidy Enterococcus faecalis
Identifikováno 18 různých plazmidů (prototyp: pAD1, 60 kb plasmid)
Faktory virulence: adhesin, matrix binding proteiny, kapsulární polysacharidy, cytolyziny (lyze erytrocytů),
želatinázy a proteázy schopné poškodit tkáně a buňky.