MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT
podzim 2016
TRANSDUKCE
Ivana Mašlaňová
iva.maslanova@gmail.com
a. Nespecifická (P 22, P 1, SPβ, φ11)abortivní
b. Specifická (fág lambda)
Přenos bakteriální DNA (chromozomové nebo plazmidové) bakteriofágem.
A. Transdukce
E. coli, S. typhimurium, Bacillus, Klebsiella, Staphylococcus, Streptococcus,
Streptomyces
Jsou př en ášeny libovolné geny
Jsou př en ášeny jen u r čit é geny
SYSTÉMY ZPROSTŘEDKOVANÉHO PŘENOSU DNA
Horizontální přenos genů zprostředkovaný
bakteriofágem = TRANSDUKCE
B. Kapsdukce
Rhodobacter capsulatus (GTA = gene transfer agent)
Methanococcus voltae (VTA = voltae transfer agens)
Objev transdukce: 1952 (Zinder a Lederberg)
Salmonella typhimurium, fág P22
• Studium auxotrofních mutant – vznik prototrofních rekombinant
• Proces není ovlivněn Dnázou
• Není nutný kontakt buněk (U-trubice)
• Přenosovým agens jsou fágy
DONOR - RECIPIENT
Transdukující částice = pseudovirion
Transduktanta
• Rekombinantní – přenos chromozomové DNA
• Abortivní – přenos chromozomové DNA
• Plazmidová – přenos plazmidů
Kotransdukce = současný přenos dvou nebo více genů donora do recipienta
transdukcí
Bakteriofág - morfologie
Podoviridae, Myoviridae Siphoviridae
SESTAVOVÁNÍ FÁGOVÝCH ČÁSTIC A SBALOVÁNÍ
DNA DO VIRIONŮ
Fágová dsDNA (19 – 500 kb) sbalována do prokapsidu (prohead)
• 3 hlavní proteiny tvořící prokapsid – „coat“ protein, „scaffolding“ protein a
„portal“ protein
• 2 proteiny odpovědné za sbalování DNA do prokapsidu – rozpoznání DNA,
přenos skrz portálový prstenec a dopravení DNA do prokapsidu
a. Lytický cyklus bakteriofága:
Adsorpce virionů na povrchové receptory
buněk; vpravení lineární dsDNA do buňky;
exprese ranných a pozdějších genů – syntéza
fágových proteinů; replikace fágové DNA –
„circle to circle“ a „rolling circle“
mechanismus; tvorba prokapsidů a bičíků;
DNA sbalována do prokapsidů – zformování
celých virionů.
b. DNA sbalovací „motor“:
Portálový prstenec na ikosahedrální fágové
hlavě; vyzba malé (TerS) a velké (TerL)
podjednotky terminázy – TerS – ATPáza, TerL –
DNA rozpoznávací protein
Struktura virionu P22
Struktura tří proteinů odpovědných za
sbalování DNA do virionu – „DNApackaging
motor“
RYCHLOST SBALOVÁNÍ FÁGOVÉ DNA DOVNITŘ VIRIONŮ
„DNA-packaging motor“ fága T4:
„coat“ protein – bílá barva; TerL –
modře; Soc – malý vnější kapsidový
protein (zeleně); Hoc – vnější
kapsidový protein (žlutě)
Fág P22HT = m ut ant ní
fág se sníženou
nuk leázovou specifit ou
rozpoznávaj ící další
„ pseudopac“ m íst a
„ Pseu dopac“ m íst o
P22HT transdukuje plazmid pBR322, který není P22 přenášen
Sbalování hostitelské DNA – bakteriofág P22
NESPECIFICKÁ TRANSDUKCE
Proces je závislý na RecA
Rekombinantní transduktanta – normální kolonie
Abortivní transduktanta – mikrokolonie
NESPECIFICKÁ A ABORTIVNÍ TRANSDUKCE
normální kolonie
mikrokolonie
ODLIŠENÍ REKOMBINANTNÍCH A ABORTIVNÍCH
TRANSDUKTANT
Transduktanty na selekčním médiu
Mikrokolonie – po přeočkování na novou selekční misku – ztráta fenotypu
CHARAKTERISTIKA NESPECIFICKY TRANSDUKUJÍCÍCH FÁGŮ
od zlomů na DNA
Chromozom
naznačen 15N Dávají vznik
transduktantům
Lyzují buňky
EXPERIMENTÁLNÍ DŮKAZ PŘÍTOMNOSTI BAKTERIÁLNÍ DNA V
TRANSDUKUJÍCÍCH ČÁSTICÍCH FÁGA P22 (při nespecifické
transdukci)
OBECNÁ TRANSDUKCE – VZNIK TRANSDUKUJÍCÍCH ČÁSTIC
1. Infikování donorového kmene fágovými částicemi
2. Bakteriální DNA degradována
3. Sestavení pseudokapsidů, plnění DNA do virionů
(rozpoznání pac místa na fágové DNA nebo
pseudo-pac místa na bakteriálním chromozomu)
4. Fágové potomstvo infikuje nového hostitele
(recipienta); transdukující viriony obsahují pouze
bakteriální DNA
5. Rekombinace transdukované bakteriální DNA s
DNA recipientní buňky
POSTUP TRANSDUKCE
recipientní
kmen
transdukující
fág
Inkubace 37°C/ 25 min.
+ CaCl2 do transdukční směsi
(1/10 celkového objemu)
+ 0,03M citrát sodný (1:1 k
celkového objemu)
Centrifugace 3000 rpm/10min./4°C.
Pelet resuspendovat v 0,017M citrátu sodném
a) misky s Cd
b) misky s tet
Příprava fágového lyzátu:
a. Indukce z donorového kmene UVzářením
nebo mitomycinem C
b. Pomnožením fágového lyzátu na
donorovém kmeni
Inkubace 37°C
UV
o A = y/ p
o y = počet transduktant pro daný znak v 1 m l
transdukční sm ěsi
o p = počet virionů ( PFU/ m l)
o Param etry ovlivňující frekvenci transdukce
• velikost genomu fága
• počet virionů uvolněných z jedné buňky (fágový výnos)
• aktivita RM systémů v recipientní buňce
• účinnost procesu rekombinace v recipientní buňce
• velikost plazmidu
STANOVENÍ FREKVENCE TRANSDUKCE
Frekvence kotransdukce = 0-100%, v závislosti na vzdálenosti markerů (referenčního a
sledovaného)
Výhoda: délka transdukovaných fragmentů je ve srovnání s transformací přesněji
definována (nízké hodnoty MOI)
závislost na RecA systému
Transdukující
částice Fág P1
leu+ donorový kmen
leu- recipientní kmen
leu+
leu+
leu+
leu-
leu+
leu-
Rekombinace
Transduktanta leu+
Transdukující
DNA obsahuje
buďgal nebo
bio anebo
gal/bio
genotyp leu-; galgenotyp
leu+; galtransdukce
leu+
kotransdukce gal a bio
kotransdukce
gal+ biogal+
bio+
gal- bio+
1
2
3
TRANSDUKCE JEDNOTLIVÝCH GENŮ KOTRANSDUKCE DVOU GENŮ
VÝPOČET VZDÁLENOSTI GENŮ Z FREKVENCE
KONTRASDUKCE
C = (1 – d/ L)3
C = frekvence kontrasdukce
d = vzdálenost markerů (min)
L = velikost transdukovaného fragmentu (min)
r ecipr ok é
VYUŽITÍ RECIPROKÉHO KŘÍŽENÍ PRO STANOVENÍ
POŘADÍ GENŮ A, B, C
Transdukovaný
fragment donora
Chromozom
recipienta
Mapování genů bakterií pomocí transdukce:
stanovení pořadí těsně vázaných genů tříbodovým křížením
s využitím parciálních diploidů
TRANSDUKCE PLAZMIDŮ
transdukovaný fragment
• transdukce plazmidů větších než je genom fága:
„transduction shortening“ - zachování počátku replikace + deletovaná část plazmidu
• transdukce plazmidů menších než je genom fága:
zabalování části konkatemerů (replikačních intermediátů - multimerů)
• transdukce vektorů odvozených z plazmidů:
interakce s homologními geny na chromozomu donora, v recipientní buňce cirkularizace
TEST INTERGENOVÉ KOMPLEMENTACE (CIS-TRANS TEST)
REALIZOVANÝ ABORTIVNÍ TRANSDUKCÍ
SPECIFICKÁ TRANSDUKCE
Specifická (specializovaná) transdukce je založena na indukci
integrovaného profága. Transdukována může být jen specifická a
omezená oblast bakteriálního chromozomu, která přiléhá k
inzerčnímu místu profága.
Modelovým systémem je transdukce zprostředkovaná fágem
lambda u E. coli.
VZNIK TRANSDUKUJÍCÍCH ČÁSTIC FÁGA λ PŘI SPECIFICKÉ TRANSDUKCI
Získání fágového
lyzátu indukcí UVsvětlem
z lyzogenních
buněk E. coli
chybná excize
genom defektní fágové částice
Frekvence vzniku transdukujících částic = 10-6 (na jeden virion lambda)
MOŽNÉ ZPŮSOBY VYČLENĚNÍ PROFÁGA LAMBDA
normální vyčlenění abnormální vyčlenění
Rekombinace v recipientních buňkách gal- infikovaných
transdukujícím fágem λdgal+
λ dgal
λ dbio
λ
GENOM TRANSDUKUJÍCÍ FÁGŮ
λdgal a λdbio
Po deleci att na bakteriálním chromozomu mohou být využita sekundární místa att
- pak dochází k transdukci jiných oblastí chromozomu.
Různé rekombinační události při specifické transdukci
t yp I
t yp I I
2xC
O
reverz
e
1xCO v gal
1xCO v att
začlenění λ (att) začlenění λ
dgal+
UV-
indukce
homologní rekombinací site-specific
integrace
HFT
Nízká
multiplicita
infekce
Vysoká
multiplicita
infekce
1% buněk bude gal- nebo gal+
- defektní
Tr ansdu kt an ty t ypu I - nelyzogen n í
Tr ansdu k t an ty t ypu I I - lyzogen n í
2xCO
1xCO
Dvojnásobně
lyzogenní kmen
(λ + λ dgal)
I nduk ce UV svět lem
Excize a zabalení fágových
genomů
Lyzát HFT ( 50% část ic j e
t r ansduk uj ících)
VZNIK LYZÁTŮ TRANSDUKUJÍCÍCH S VYSOKOU FREKVENCÍ
(LYZÁT HFT)
VYUŽITÍ TRANSDUKCE
• Analýza specifických oblastí bakteriálního genomu (gal operon)
• Mapování genů
• Charakterizace transpozonů – heteroduplexní analýza
• Analýza fágových genomů při konstrukci vektorů (odvozených z fága lambda)
• HGT: Objasnění evoluce bakteriálních genomů
• DNA ve fágové částici je chráněna před působením nukleáz
• Řada fágů má široké rozmezí hostitelů (P1 – infikuje G- bakterie)
• Mohou být přenášeny plazmidy nebo transpozony s širokým rozmezím hostitelů,
chromozomové geny jen v případě homologie
Přenos (transdukce) ostrovů patogenity u S. aureus
SaPI1: 15 kb ostrov patogenity u S. aureus, nesoucí gen tst zodpovědný za syndrom
toxického šoku (TSST1) - (horečka, exantém, hypotenze, olupování kůže).
SaPI1 je mobilizován fágem 80α. Když fág 80α infikuje buňky S. aureus nesoucí
SaPI1, vyčleňuje se ostrov z chromozomu a replikuje se pomocí proteinů fágového
replikačního aparátu. Geny ostrova způsobí, že fág 80α vytváří menší hlavy, které
pak zabalují přednostně DNA ostrovů spíše než vlastní fágovou DNA. Když
vytvořený „pseudofág“ infikuje další buňku, je DNA ostrova injikována do buňky,
kde se začleňuje do chromozomu pomocí svého vlastního Int proteinu.
SaPI částice
Ost r ov pat ogenit y
G eny pro v iru lenci
Př ím á opak ování
Počet nuk leot idů
I nzer ční
sek vence
Gen pro
in tegrázu
OBECNÁ STRUKTURA OSTROVŮ PATOGENITY
VÝZNAČNÉ RYSY OSTROVŮ PATOGENITY
• Nesou jeden nebo několik genů pro virulenci
• Jsou přítomny jen u patogenních kmenů daného druhu
• Představují relativně velké úseky genomu (10 – 200 kb)
• Mají odlišný obsah GC a jiné využívání kodonů
• Jsou často umístěny poblíž genů pro tRNA (kotvy pro inzerci cizí DNA)
• Jsou často spojeny s mobilními genetickými elementy.
• Často jsou ohraničeny DR (16-130 bp) - rozpoznávací místa pro enzymy zajišťující
integraci a excizi mobilních elementů (integráza nebo transponáza)
• Jsou často nestabilní a jsou deletovány s různými frekvencemi.
• Mají mozaikovitou strukturu – jsou složené z elementů, které se během evoluce
v různé době a z různých zdrojů akumulovaly do určitých míst.
MODEL AUTOTRANSDUKCE
Nature Communications, 2016
LYZOGENNÍ KONVERZE
Změna vlastností kmene po infekci fágem, který ve svém genomu nese geny
zodpovědné za změnu fenotypu hostitele (faktory virulence nebo toxiny).
Příklady:
Fág lambda: E. coli – rezistence k séru, schopnost přežívat v makrofágách
Fág φ361 (příbuzný fágu lambda): E. coli – Shiga toxin
Fág β : Corynebacterium diphtheriae – difterický toxin (záškrt)
Fág CTXφ: Vibrio cholerae – toxin cholery
Fágy u S. aureus: fibrinolyzin, enterotoxin
Fágy beta-hemolytických streptokoků sk.A: erytrogenní toxiny
Fág u Clostridium botulinum: botulotoxin
Fág u Clostridium tetani: tetanotoxin
Fág u Salmonella: změny somatických antigenů
Kapsdukce - Rhodococcus capsulatus
Rhodobacter capsulatus
Domain: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Class: Alphaproteobacteria
Order: Rhodobacterales
Family: Rhodobacteraceae
Genus: Rhodobacter
Species: R. capsulatus
8 proteinů, průměr hlavy 30 nm, bičík 30-50 nm. Nebyly identifikovány fágy příbuzné s GTA.
PARAMETRY PŘENÁŠENÉ DNA KAPSDUKCÍ
• velikost přenášené DNA = 1,5-2 kb (až 5 kb)
• DNA je heterogenní, tj. je bakteriální
• přenos až 3-4 genů na jednu částici GTA
• 105 GTA/ml pro daný marker
• přenos všech chromozomových markerů
• frekvence rekombinant 10-4/-5/marker/buňku
• frekvence „kotransferu“ genů F = 1 - (dL)2
• (d = vzdálenost markerů, L = délka přenášeného úseku DNA)
Přenos je regulován bakteriálními geny, které indukují expresi strukturních genů
GTA během specifické růstové fáze buněk
Další GTA – Silicibacter pomeroyi aj. mořský bakterioplankton - počet genů kódujících
kapsid, bičík, portál, zabalování DNA
= zhruba 15 genů podobných GTA u R.c.
Úloha GTA v evoluci mořských bakterií
Roseovarius nubinhibens, Reugeria mobilis
• GTA přenášejí geny mezi různými druhy mořských bakterií
• Frekvence přenosu genů = 6.7 × 10−3 až 4.7 × 10−1 jsou tisíckrát až milionkrát
vyšší než frekvence přenosu transformací nebo transdukcí.
• Umělý přenos genů AntR v uzavřených nádobách s mořskou vodou – až 47%
bakterií získalo tyto geny a integrovalo je do svého genomu
• Stejný způsob přenosu genů i mezi klinickými kmeny?
GTA = „promiscuous little bastards“