P02
Biochemické identifikační
metody
Diagnostika streptokoků
Bi7170c (podzim 2015)
Osnova
●
biochemické identifikační metody substrátové
– metody rychlé, metody s kultivací
●
nesubstrátové identifikační metody
●
rod Streptococcus
●
dg. rodu Streptococcus
●
úkoly
2/52
Přehled identifikačních metod
●
přímé metody (mikrob, jeho část, produkty)
– mikroskopie (průkaz ve vzorku i identifikace)
– kultivace (průkaz + identifikace)
– biochemická identifikace (jen identifikace)
– průkaz antigenu (průkaz + identifikace)
– průkaz NK (průkaz ve vzorku)
– pokus na zvířeti (průkaz ve vzorku)
●
nepřímé metody (průkaz protilátek)
3/52
Biochemická identifikace
●
rozdíly v metabolismu mezi bakteriemi
●
bakterie mění substrát (cukry, AMK, apod.) v produkt(y)
●
ideálně se produkt a substrát liší skupenstvím nebo
barvou
●
pokud se neliší, užijeme vhodný indikátor
●
sledujeme více než jeden znak (atypické kmeny,
možnost rozlišit více rodů a druhů)
●
% pravděpodobnosti
●
index typičnosti (shoda s „ideálním“ kmenem:
Tin = 1,00)
4/52
% pravděpodobnosti, Tin
● 99 %, Tin = 0,95
(ideální stav)
● 99 %, Tin = 0,63
atypický kmen nebo chyba diagnostiky
● 49,5 %, Tin = 1,00
test je typický pro dva taxony, musíme dále rozlišit
pomocí jiného testu
5/52
Rychlé biochemické testy
●
katalázový test
– kataláza – antioxidační enzym, chrání před
oxidačním stresem
– do substrátu (H2O2) rozmícháme bakterie
– POZ = viditelné bublinky
6/52
Testy s diagnostickými proužky
●
Oxidáza – cytochromoxidázový test
– využívání cytochrom c oxidázy pro produkci energie
– OXI+ (bakterie využívá cytochrom c oxidázu, a tedy
O2 jako terminální akceptor elektronů pro produkci
energie); P. aeruginosa,
V. cholerae
– OXI- (bakterie využívá
pro produkci energie jiné
cytochromy, nebo O2 pro
produkci energie
nevyužívá vůbec);
většina rodů čeledi
Enterobacteriaceae
7/52
Testy s diagnostickými proužky (2)
●
PYR test
– enzym PYRáza (pyrrolidonyl arylamidáza)
– odlišení S. pyogenes od ostatních β-hemolytických
streptokoků
●
INAC test (Indoxyl-acetátový test)
– odlišení M. catarrhalis od N. meningitidis a
N. gonorrhoeae
●
stripy pro detekci běžných β-laktamáz
8/52
Jednoduché zkumavkové testy
●
substrát je rozpuštěn v tekutině, přimícháme
testovaný kmen změna zbarvení v celém objemu, nebo→
jako prstenec u hladiny
– arabinózový test pro rozlišení E. faecalis a E. faecium
POZ = žlutá (E. faecium)
NEG = zelená (E. faecalis)
●
kmen je rozmíchán v tekutině, přidáme proužek
napuštěný substrátem
– VPT test pro detekci tvorby acetoinu (POZ = červená)
– ONPG test pro detekci β-galaktosidázy;
rozlišení rodů Citrobacter (POZ = žlutá) a Salmonella
(NEG = bezbarvá)
9/52
Jednoduché zkumavkové testy (2)
●
agar obsahující substrát
– Citrát dle Simmonse pro detekci růstu bakterií na
citrátu jako jediném zdroji uhlíku;
rozlišení Enterobacter aerogenes
(POZ = modrá) a
E. coli (NEG = tmavě zelená)
10/52
Složité zkumavkové testy
●
test (půda) MIU (Motility, Indol, Urea)
– pohyb – pohyblivé bakterie rostou do okolí vpichu,
nepohyblivé podél vpichu (shigelly)
– tvorba indolu – po přidání Kovácsova činidla se
vytvoří červený prstenec
– štěpení urey – půda se zbarví fialově
11/52
Složité zkumavkové testy (2)
●
Hajnova půda (Kligler's Iron Agar, KIA)
– štěpení laktózy (A = NEG, B = POZ)
– štěpení glukózy (C = NEG, D = POZ)
– produkce H2S (POZ = zčernání půdy)
– tvorba plynu (POZ = potrhaná půda,
bublinky, půda vysunutá nahoru)
– očkování vpichem
a tzv. hádkem
12/52
Příklad vyhodnocení Hajna+MIU
Test Hajna MIU
Reakce Glc Lac H2
S Mot Ind Ure
P. aeruginosa - - - - - (+)
E. coli + + - + + P.
mirabilis + - + + - +
S. Enterica + - + (+) - C.
freundi + (+) (+) + - -
13/52
Testy v plastových panelech
●
miniaturizace sady jednoduchých zkumavkových testů
●
počty testů v sadách se liší
●
destičky s lyofilizovanými substráty
●
přidání suspenze bakterií ve fyz. roztoku nebo
v dodaném suspenzním médiu
●
zbytek bakteriální suspenze se využije jako
zkumavkový test (VPT, ONPG)
●
u nás nejběžnější testy od firmy Erba Lachema
(např. STAPHYtest 16, STREPTOtest 16, ENTEROtest
16, NEFERMtest 24, apod.)
14/52
Testy v plastových panelech (2)
●
NEFERMtest 24 (Erba Lachema)
– jeden test tvoří tři řádky
po osmi jamkách
●
API 20 E (bioMérieux)
– princip stejný, provedení se
mírně liší
15/52
Vyhodnocení destičkových testů
●
oktalové kódy podle poz. a neg. výsledků
●
trojici výsledků se přiřadí číslice od nuly po sedmičku
(dvojice výsledků pak číslice nula až tři)
●
kód vyhledáme v kódové knize nebo v příslušném
softwaru
16/52
Další identifikační testy
●
zkoumání další enzymové výbavy či faktorů virulence
– schopnost koagulovat králičí plazmu
– hyaluronidázový test
– testování pohyblivosti
– diagnostické použití ATB (optochin, bacitracin)
●
nové identifikační metody
– MALDI-TOF (ionizace laserem za přítomnosti matrice,
spojení s detektorem doby letu)
17/52
MALDI-TOF
●
rozdělení nabitých částic podle jejich molekulových
hmotností v elektrickém/magnetickém poli
●
díky matrici lze analyzovat i velké biomolekuly (při
přímé ionizaci vzorku laserem dochází ke štěpení molekul
nežádoucím způsobem)
●
směs vzorku a matrice je ionizována laserem ionty→
analyzované látky jsou urychleny silným elektrickým
polem vstupují do trubice detektoru měření doby→ →
letu částice výpočet poměru molekulové hmotnosti a→
náboje částice
●
hmotnostní spektrum se poté porovnává se
známými profily uloženými v knihovně
18/52
Rod Streptococcus
●
G+ koky, KAT-, OXI-
●
dvojice, řetízky
●
nepohyblivé
●
kultivace na KA
●
rozdělení dle hemolýzy (α – viridující, β – hemolitické,
γ – nehemolytické)
●
dělení dle Lancefieldové: antigenní skupiny, nejčastěji
A, B, C, E, F, G, H, ...
(skup. D – dnes enterokoky, S. bovis)
19/52
Přehled streptokoků
Změny na KA
α-hemolýza
(viridace)
Streptococcus pneumoniae
skupina „ústních streptokoků“
β-hemolýza Streptococcus pyogenes (sk. A dle
Lancefieldové)
Streptococcus agalactiae (sk. B dle
Lancefieldové)
skupina „non-A-non-B“ streptokoků
γ-hemolýza
(žádná)
streptokoky bez hemolýzy
20/52
Streptococcus pyogenes
●
streptos = ohebný, zkroucený jako řetěz; puon = hnis;
gennao = tvořit
●
group A streptococcus (GAS)
●
úplná β-hemolýza,
drobné kolonie
●
PYR test, bacitracinový test
●
původce akutní tonsilitidy (angíny), hnisavých
zánětů měkkých tkání (nekrotizující fasciitis),
spály, erysipelu (tzv. růže) a flegmón (neohraničených
bakteriálních zánětů), pneumonií, meningitid, sepsí;
●
pozdní následky (revmatická horečka, akutní
glomerulonefritida) - ASLO
21/52
Akutní tonsilitida (angína)
●
nejčastější bakteriální původce S. pyogenes
●
další původci: S. pneumoniae, staphylokoky, hemofily,
influenza virus, herpes viry, coxsackie viry, EBV, ...
●
horečka, oboustranná bolest v krku, zduřené uzliny
22/52
Spála (scarlatina)
●
angína s exantémem a projevy na sliznici (petechie)
●
streptokok produkuje pyrogenní (erytrogenní) toxin
23/52
Erysipel (růže)
●
ostře ohraničený zánět, nejčastěji v oblasti bérců a
obličeji
●
infekce kůže se šíří do kožních lymfatických cév, při
opakovaném poškození chronické lymfatické otoky
24/52
Streptococcus agalactiae
●
aglactia = porucha tvorby mléka (záněty mléčné žlázy
především u krav)
●
group B streptococcus (GBS)
●
neúplná β-hemolýza, větší kolonie
●
pozitivní CAMP test
●
původce močových infekcí (u žen
v urogenitálním traktu a GIT)
●
infekce novorozenců (sepse, pneumonie,
meningitidy)
●
infekce gravidních žen
25/52
„non-A-non-B“ streptokoky
●
β-hemolýza, ale nepatří ani do GAS (S. pyogenes) ani
do GBS (S. agalactiae)
●
faryngitidy (záněty hltanu), často přítomny bez
klinických projevů
●
S. dysgalactiae, S. equi
●
obyčejně se neurčují, v případě potřeby se blíže
identifikují průkazem antigenu
26/52
Streptococcus pneumoniae
●
„pneumokok“, dříve Diplococcus pneumoniae
●
dvoří dvojice (nikoli řetízky), lancetovitý
(kopíčkovitý) tvar buněk
●
α-hemolýza
●
opouzdřené buňky mají hlenovité kolonie (kapky oleje)
●
v R-fázi netvoří pouzdro
●
v malém množství i u zdravých osob
●
sinusitidy, pneumonie, otitis media, meningitidy,
sepse, endokarditidy
●
nepovinné očkování (Pneumo23, Prevenar13, Synflorix)
27/52
Streptococcus pneumoniae (2)
28/52
„Ústní streptokoky“
●
též alfa streptokoky nebo viridující streptokoky (obvykle
α-hemolytické streptokoky, kromě pneumokoka)
●
normální součástí mikroflóry ústní dutiny a částečně i
faryngu
●
fyziologicky se neustále dostávají v malém množství do
krve (ve velkém množství způsobují subakutní
bakteriální endokarditidy - adherují na poškozené
srdeční chlopně)
●
útvar na chlopni = „vegetace“ - forma biofilmu (matrix
tvoří krevní destičky a fibrin)
●
S. mutans – zubní kaz (nejrychleji tvoří org. kyseliny)
●
S. salivarius, S. sanguinis, S. mitis
29/52
„Ústní streptokoky“ (2)
30/52
Streptococcus salivarius K12
adherovaný k HEp-2 buňkám
Léčba
●
lék volby penicilin
●
při prokázaných alergiích makrolidy
●
léky další volby doxycyklin, kotrimoxazol, ampicilin, aj.
●
rezervní ATB vankomycin (zatím žádné rezistence)
●
testování in vitro citlivosti – difuzní diskový test na MH
agaru s krvinkami (na obyčejném MH agaru prakticky
nerostou)
31/52
Diagnostika streptokoků
●
mikroskopie: G+ koky
●
kultivace: na KA kolonie šedé až bezbarvé, většinou
drobné, S. agalactiae má větší kolonie
●
hemolýza: α- β- i γ-hemolýza
●
nerostou na KA s 10 % NaCl (půda pro stafylokoky),
ani na Slanetz-Bartley či žluč-eskulinové půdě (pro
enterokoky)
●
KAT-, OXI-
●
rezistentní na aminoglykosidy (společně s
enterokoky)
32/52
Diagnostika streptokoků (2)
●
streptokoky s αhemolýzou
(viridací)
lze dále určovat
biochemickými testy
●
např. při nálezu v
hemokultuře nebo likvoru
dourčujeme původce
●
vzorek z dutiny ústní či
krku nikoliv, jsou tam
běžnou flórou
33/52
●
streptokoky s β- a γhemolýzou
lze dále
určovat latexovou
aglutinací (protože mají
slabou biochem. aktivitu)
●
určení non-A-non-B
streptokoků dle
Lancefieldové
Diferenciální dg. streptokoků
●
hodnotíme hemolýzu (viridace, hemolýza částečná či
úplná, bez hemolýzy)
●
β-hemolýza:
– S. pyogenes (poz. PYR test a bacitracinový test)
– S. agalactiae (poz. CAMP test)
●
α-hemolýza:
– S. pneumoniae poz. optochinový test na rozdíl od
ostatních viridujících streptokoků
34/52
Diferenciální dg. streptokoků (2)
35/52
G+ kok
stafylokok streptokok enterokok
streptokok
s viridací
streptokok
s hemolýzou
streptokok
bez hemolýzy
S. pneumoniae
ústní streptokok
S. pyogenes (SAG)
S. agalactiae (SBG)
non-A-non-B streptokok
Úkol 1: Mikroskopie kmenů
●
obarvěte podle Grama všech osm kmenů
●
jeden z kmenů bude G- tyčinka (výsledek si
poznamenejte a dále s ním nebudeme pracovat)
36/52
Úkol 2: Kultivační a biochem. testy
●
Úkol 2a: Katalázový test k odlišení stafylokoků
– kolonie vmícháme do kapky H2O2
– POZ = bublinky (stafylokok dále s kmenem→
nepracujeme)
– NEG (streptokok nebo enterokok)
●
Úkol 2b: Růst na Slanetz-Bartleyově agaru
– POZ = růst kmenu (enterokok dále s kmenem→
nepracujeme)
– stejnému účelu sloužila i žluč-eskulinová půda
37/52
Úkol 3: Kultivace na KA
●
pozorujte a zapište typ hemolýzy (viridace,
částečná hemolýza, úplná hemolýza, beze změny)
●
popište další vlastnosti kolonií (snažte si
povšimnout rozdílů mezi jednotlivými kmeny, tj.
různých velikostí, pigmentace, typu hemolýzy apod.)
38/52
Úkol 4: Streptokoky s viridací
●
Úkol 4a: Optochinový test
– odlišení S. pneumoniae od ostatních viridujících
streptokoků
– pneumokok je citlivý k optochinu, neměříme zónu
inhibice (optochin se dnes již nepoužívá léčebně,
zůstal jen v diagnostice)
●
Úkol 4b: Biochemické určení „ústního“ streptokoka
– streptokoky z likvoru a hemokultur
– STREPTOtest 16 (17 reakcí: 1. je VPT, 2. až 9. jsou
v prvním řádku, 10. až 17. jsou ve druhém řádku)
39/52
Úkol 5: Streptokoky s hemolýzou
●
Úkol 5a: PYR test
– diagnostický proužek
– kolonie se umístí na reakční plošku proužku, po 10
minutách se přikápne činidlo
– POZ = červené zbarvení
●
Úkol 5b: CAMP test
– příklad synergického působení dvou hemolyzinů,
a to hemolyzinu S. agalactiae a β-hemolyzinu
S. aureus
– nelze použít k dg. S. aureus (ne všechny zlaté
stafylokoky produkují β-hemolyzin)
40/52
Úkol 5b: CAMP test
41/52
●
na agar se naočkuje laboratorní kmen zlatého
stafylokoka tvořící β-hemolyzin, kolmo k němu se
očkují testované kmeny
Úkol 5c: aglutinační test
●
lahvičky se směsí latex.
částic s navázanými
protilátkami
●
z obrázku určete, se
kterým testovaným
sérem kmen aglutinuje
42/52
Úkol 6: test citlivosti na ATB
●
odečtěte difusní diskový test – změřte zóny a
porovnejte s referenčními hodnotami
●
horší patogeny většinou citlivější než mírnější
patogeny
●
využíváme MH agar s krvinkami (na běžném MH by
většina streptokoků nevyrostla)
43/52
Úkol 7: Dg. pozdních následků
streptokokových infekcí - ASLO
●
po každé streptokokové infekci protilátky, vč. protilátek
proti streptolyzinu O (streptokokový toxin)
●
v případě, že množství těchto protilátek po infekci
stoupá, zkříženě reagují s některými strukturami
organismu → pozdní následky streptokokových
infekcí
●
revmatická horečka, akutní glomerulonefritida
●
ASLO: zjištění míry protilátkové odpovědi po
prodělané streptokokové infekci (neprokazujeme tedy
infekci – ta už proběhla – ale zda nedochází k vývoji
autoimunitní reakce)
44/52
Úkol 7: ASLO
●
neutralizace hemolýzy
●
streptolyzin O za běžných okolností (nepřítomnost
protilátek) hemolyzuje červené krvinky
NEG = hemolýza
●
v přítomnosti protilátky antistreptolyzinu O dochází
k zábraně hemolýzy a krvinky mohou sedimentovat
POZ = zábrana hemolýzy
●
titr nad cca 200 m.j. riziko pozdních následků
45/52
Jamka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hodnota
m.j.
100 120 150 180 225 270 337 405 506 607 759 911
Pozdní
následky
nehrozí
hra-
niční
hrozí
Úkol 7: ASLO (2)
●
destička se odečítá naležato, první řádek je
pozitivní kontrola
●
další řádky jsou jednotliví pacienti
●
hodnoty ředění jsou uvedeny v protokolu
46/52
Úkol 8: Demonstrace dalších testů
●
Úkol 8a: Oxidázový test (POZ = modrá do 2 min)
●
Úkol 8b: ONPG test (POZ = žlutá po 4 hod)
● Úkol 8c: Tvorba H2S, štěpení sacharidů a produkce
plynů v Hajnově půdě.
●
Úkol 8d: Průkaz pohyblivosti, tvorby indolu a štěpení
urey (MIU)
47/52
Úkol 8a: Oxidázový test
●
Oxidáza – cytochromoxidázový test
– Využívání cytochrom c oxidázy pro produkci energie
– OXI+ (bakterie využívá cytochrom c oxidázu, a tedy
O2 jako terminální akceptor elektronů pro produkci
energie); P. aeruginosa,
V. cholerae
– OXI- (bakterie využívá
pro produkci energie jiné
cytochromy, nebo O2 pro
produkci energie
nevyužívá vůbec);
většina rodů čeledi
Enterobacteriaceae
48/52
Úkol 8b: ONPG test
●
ONPG test pro detekci β-galaktosidázy
●
filtrační papírek na diagnostickém proužku je napuštěn
vhodným reagens (o-nitrofenyl-β-D-galaktopyranosid –
analog laktózy), vkládá se do bakteriální suspenze
●
POZ = žlutá
●
NEG = bezbarvá
49/52
Úkol 8c: Hajnova půda
●
Hajnova půda (Kligler's Iron Agar, KIA)
– štěpení laktózy (A = NEG, B = POZ)
– štěpení glukózy (C = NEG, D = POZ)
– produkce H2S (POZ = zčernání půdy)
– tvorba plynu (POZ = potrhaná půda,
bublinky, půda vysunutá nahoru)
– očkování vpichem
a tzv. hádkem
50/52
Úkol 8d: MIU
●
test (půda) MIU (Motility, Indol, Urea)
– pohyb – pohyblivé bakterie rostou do okolí vpichu,
nepohyblivé podél vpichu (shigelly)
– tvorba indolu – po přidání Kovácsova činidla se
vytvoří červený prstenec
– štěpení urey – půda se zbarví fialově
51/52
Po tomto cvičení byste měli umět:
●
vysvětlit význam biochemických identifikačních metod
v mikrobiologii, popsat konkrétní příklady využití
v diagnostice
●
popsat zástupce rodu Streptococcus, vč. diagnostických
postupů, které vedou k úspěšné identifikaci
●
zhodnotit možnost tvorby biofilmu na srdečních
chlopních a případných následků tohoto stavu
●
vysvětlit význam testu ASLO a vysvětlit vztah
k pozdním následkům streptokokových infekcí
52/52