DALŠÍ G- BAKTERIE
praktikum č. 5
Lékařská mikrobiologie – cvičení
Mikrobiologický ústav LF MU
http://colloidalsilversecrets.blogspot.cz

Přehled G- bakterií



Obsah cvičení
}Čeleď Pasteurellaceae
§Hemofily
§Pasteurella multocida
§Charakteristika, význam, léčba
§Diagnostika
}G- nefermentující bakterie
§Pseudomonády
§Ostatní G- nefermentující bakterie
§Charakteristika, význam, léčba
§Diagnostika
§
}

}Krátké G- tyčinky, pod mikroskopem – od malých kokobacilů po dlouhé tyčky.
}Nerostou na Endu ani na KA �
}nedokáží získat z erytrocytů potřebné
}růstové faktory. Na KA rostou pouze
}při společném růstu s jinými
}mikroorganismy (satelitový fenomén).
}Růst na čokoládovém agaru.
}
Čeleď Pasteurellaceae – rod Haemophilus
http://www.co.monroe.mi.us
28 Hib

Klasifikace hemofilů
}Haemophilus influenzae:
§pouzderný typ b (Hib)
§pouzderné typy a, c, d, e, f
§neopouzdřené kmeny
}Haemophilus parainfluenzae (mnohem běžnější a mnohem méně patogenní).
}Haemophilus aphrophilus
}Haemophilus ducreyi, původce pohlavně přenášené choroby ulcus molle
}Velmi běžná je přítomnost hemofilů v krku à pochybná patogenní role (zvlášť v případě Haemophilus
parainfluenzae nepředpokládáme, že by byl patogenem).

Hemofily – klinický význam
•Haemophilus influenzae
}Virulentní kmeny mají polysacharidové pouzdro (a až f), nejčastěji typ b (Hib).
}Nejzávažnější – invazivní infekce u předškolních dětí – epiglotitida (zánět hrtanové příklopky),
meningitida, pneumonie a sepse.
}Dále otitis media a sinusitida.
}Od roku 2001 povinné očkování dětí.
•

•Haemophilus ducreyi
}Ulcus molle – měkký vřed –
•pohlavní choroba vyskytující se
•především v subtropických a
•tropických oblastech.
}
•
}
}Pozor – ulcus durum – tvrdý vřed – jeden z příznaků syfilis, způsobené Treponema pallidum
}
•
•
•
}
}
www.fmt.am.gov.br
Hemofily – klinický význam
22 Cancro

}Hemofily vyžadují z erytrocytů určité růstové faktory, jejichž potřeba je druhově specifická:
§H. parainfluenzae vyžaduje faktor V (= NAD)
§H. aphrophilus vyžaduje faktor X (= hemin)
§H. influenzae vyžaduje oba faktory.
}
•
•
•
}
}
www.medmicro.info
Hemofily – růstové faktory

}
•
}
}
•Pasteurella multocida
}Běžná součást mikroflóry psích tlam.
}Člověk – zhnisání ran způsobených pokousáním od psa.
}„Prý“ charakteristický pach (podobný hemofilovému, možné přirovnání k zápachu starého hadru).
}Neroste na Endu, roste na KA v koloniích podobajících se streptokokům a enterokokům.
}Rezistentní na vankomycin (pozor na VRE!) a citlivá na penicilin à indikátor.
§
•
Čeleď Pasteurellaceae – rod Pasteurella

G- nefermentující bakterie – charakteristika (GNFB)
}Obecně:
§striktní aerobové
§bakterie z vnějšího prostředí (saprofyté), často rostlinné patogeny
§nefermentují – degradují cukry aerobní respirací, a jejich adaptace na vnější prostředí se
projevuje i jinak – často mají nízké teplotní optimum a často jsou pigmentované, tím vzdorují
slunci ve vnějším prostředí
}Patří sem (mimojiné): Pseudomonas aeruginosa, rody Acinetobacter, Burkholderia nebo
Stenotrophomonas
•

}Bakterie z vnějšího prostředí – zdravého člověka většinou nenapadají. }Cílem jsou
imunokompromitovaní pacienti – s popáleninami, pacienti JIP, po transplantacích atd.
•U dlouhodobě hospitalizovaných nezpůsobují jen infekce ran, ale často je nacházíme i např.
v dýchacích cestách či dokonce v krevním řečišti. Záněty nehtového lůžka.
•Jde tedy o důležité původce nozokomiálních nákaz.
•Někdy je ale těžké odlišit pouhou kolonizaci od skutečné infekce – zvláště u povrchových ran často
nemá smysl používat celkovou antibiotickou léčbu při nálezu některé z těchto bakterií.
}
G- nefermentující bakterie: patogenita

}G- rovná tyčinka.
}Charakteristický zápach (jasmín) a barva (zelený pigment, vzácně modrý).
}Vyskytuje se v odpadní vodě, střevě obratlovců, na rostlinách a v půdě.
}Významný původce nozokomiálních nákaz, kolonizuje vlhká místa pacienta (uši, podpaží,..).
}Významný původce infekcí popálenin,
•těžkých operativních výkonů, kolonizace
•katétrů, napadají pacienty s malignitami,
•cystickou fibrózou atd.
§
G- nefermentující bakterie – Pseudomonas aeruginosa
Foto: archiv ústavu

G- nefermentující bakterie a cystická fibróza
}Cystická fibróza je těžké, vrozené onemocnění plic s poruchou produkce normálního plicního
surfaktantu. To vede ke změněným charakteristikám plic, včetně mnohonásobně zvýšeného rizika
infekce.
}Nejčastějšími původci jsou:
§Pseudomonas aeruginosa
§Burkholderia cepacia
§Staphylococcus aureus
}Kmeny zpravidla získají polyresistenci.

§
www.bact.wisc.edu
G- nefermentující bakterie: Pseudomonas fluorescens
}Podobná P. aeruginosa, ale typická fluorescence kolonií pod UV lampou.
§

}Burkholderia cepacia způsobuje hnilobu cibule (Allium cepa), je to tedy typický rostlinný patogen.
Nozokomiální infekce dýchacích cest.
}
}
•
•
}Burkholderia pseudomallei je původcem těžkého onemocnění: melliodiózy. }Burkholderia mallei
způsobuje zoonózu zvanou malleus (česky vozhřivka). Je nebezpečná i pro člověka.
}
G- nefermentující bakterie – rod Burkholderia
34 Burkholderia%20cepacia%20fig18
•http://www.microbelibrary.org

}Stenotrophomonas maltophilia – respirační infekce, infekce ran, infekce močových cest. •Pozn. k
názvu - Stenotrophomonas maltophilia – jméno dle úzkého spektra výživy, „maltózu-milující“.
}Acinetobacter sp. – nepohyblivý (z řečtiny – a-kineto).
G- nefermentující bakterie: Stenotrophomonas maltophilia a Acinetobacter sp.
•http://clinicalmicrobiology.stanford.edu
•http://www.bakteriologieatlas.de
•
38 Acinetobacter_calcoaceticus_04-2Tag-Columbia

}Kultivační půda:
§Pasteurely rostou na KA x hemofily nerostou na KA, ale na čokoládovém agaru.
}Růst hemofilů na KA:
§Hemofily rostou na KA pouze v přítomnosti takové bakterie, která jim krvinku „otevře“ (satelitový
fenomén). Takovou bakterií je například zlatý stafylokok.
}Velikost kolonií:
§Velmi drobné kolonie àpoužívá se disk napuštěný k bacitracinem k odclonění ostatních bakterií (ve
vyšší koncentraci než v bacitracinovém testu).
§
Diagnostika hemofilů a pasteurel

}Hemofily potřebují pro zisk růstových faktorů z erytrocytů tyto erytrocyty rozrušit. To je možné:
§Zahřátím agaru = čokoládový agar
§Přítomností jiného mikroba = satelitový fenomén – vyočkování hemofiů přes celou misku a vprostřed
misky naočkovaný pruh Staphylococcus aureus à rozruší erytrocyty a umožní tak růst hemofilů na KA.
•
•
}
•
Diagnostika hemofilů –
satelitový fenomén

}Růstové faktory hemofilů:
§H. parainfluenzae vyžaduje faktor V (= NAD)
§H. aphrophilus vyžaduje faktor X (= hemin)
§H. influenzae vyžaduje oba faktory.
}
•
Diagnostika hemofilů –
růstové faktory

}Komerční soupravy, včetně latexových částic.
}Koaglutinace = reakce se stafylokokem à aglutinát byl hustší díky navázání stafylokoka na Fc konec
protilátky proti hemofilovi.
•
Diagnostika hemofilů a pasteurel – antigenní analýza

}G- nejsou citlivé na vankomycin (ten však působí na všechny streptokoky, většinu stafylokoků a
enterokoků).
}Málo G- je také citlivých na penicilin.
•à citlivost na penicilin a rezistence k vankomycinu à rod Pasteurella.
}
}Pozn. k hemofilům: Hemofily se na ATB citlivost testují na Levinthalově agaru (přefiltrovaný
čokoládový agar).
Diagnostika pasteurel –
vzorce citlivosti na ATB

Diagnostika GNFB
}Mikroskopie – až na rod Acinetobacter jde o G- tyčinky.
}Kultivace – růst na většině půd, nefermentují glukózu a většinou ani laktózu. }Biochemie – lze
použít, ale pouze u testů zjišťujících aerobní respiraci. Nutná kultivace testu při snížené teplotě
a prodloužené době. }Antigenní analýza, detekce DNA – rutinně se nepoužívá.

Diferenciální diagnostika GNFB (1)
}Gramovo barvení: G- tyčinky × jiné bakterie
}Endova půda: rostou
}Nefermentující se odliší od enterobakterií/vibrií tím, že nefermentují glukózu. à na Hajnově půdě
nedochází k žádné změně barvy = zůstává celá červená (může být lehce nahnědlá – pigmenty).

Diferenciální diagnostika GNFB (2)
}Pseudomonády:
§Mladé kultury mají typickou vůni
§Tvoří pigmenty (hlavně zelené – pigment pyoverdin, vzácně modré, narezavělé)
§Kolonie jsou nejlépe viditelné na MH, ale rostou i na KA, Endo (zde mají perleťový lesk)
§Oxidáza pozitivní
}Ostatní nefermentující, případně sporné pseudomonády à biochemie à NEFERMtest 24 (v kombinaci s
oxidázovým testem).

Diferenciální diagnostika GNFB (3)
}Oxidáza:
§Pozitivní: Pseudomonas, Burkholderia
§Negativní: Stenotrophomonas, Acinetobacter

NEFERMtest 24
}Trojstrip (minulý týden byl dvojstrip)
}Tvorba kódu:
§První číslice je 0 (oxidáza negativní) nebo 1 (oxidáza pozitivní).
§Dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C.
§Sloupce A a B se nepočítají (používají se
•jen pro případné další rozlišení.
§Jedna destička – 4 kmeny po třech řádcích,
•pro každý kmen 24 reakcí.

ATB citlivost GNFB
}GNFB rostou na většině médií.
}Pro léčbu i testování se používají silná ATB nevhodná k použití u běžných bakterií �
§cefalosporiny 3. generace, často v kombinaci s inhibitory betalaktamáz.
§pseudomonádové cefalosporiny: protipseudomonádové peniciliny, monobaktamy a karbapenemy (imipenem,
piperacilin/tazobactam)
§aminoglykosidy (gentamicin, amikacin)
§fluorochinolony (ciprofloxacin, ofloxacin)
§polypeptidy (kolistin)

Úkol č. 1 – Gramovo barvení
}Obarvěte podle Grama 12 podezřelých kmenů (pro zopakování: natřít à nechat uschnout à fixovat
plamenem à poté barvit: Gram 30 s à Lugol 20-30 s à opláchnout vodou à alkohol 15-20 s à opláchnout
vodou à safranin 60 à opláchnout vodou à osušit filtračním papírem (nedrhnout buničinou ani ničím
jiným!) à imerzní objektiv - olej)
}Odlišíte G+ bakterie od G- tyčinek/koků.

Úkol č. 2 – Kultivace na agarových půdách
}Popište nárůst kolonií na KA, ty které zde nerostou popište na čoko agaru. }Popište růst na Endově
půdě – rostou x nerostou. Neposuzujte fermentaci laktózy – nemáme izolované kolonie. }U jednoho
kmene rostoucího na MH agaru si povšimněte tvorby pigmentů (pokud nějaké jsou). Tuto misku využijte
i pro úkol 6b.
}Růst na KA: nerostou na něm hemofily
}
•

Úkol č. 3 – Identifikace Pasteurellaceae a jejich přesnější určení (1)
}3a) Satelitový fenomén – růst hemofilů na KA kolem linie naočkovaného stafylokoka à satelit.
Zakreslete, popište.
}3b) Identifikace hemofilů podle potřeby růstových faktorů:
§H. parainfluenzae vyžaduje faktor V (= NAD)
§H. aphrophilus vyžaduje faktor X (= hemin)
§H. influenzae vyžaduje oba faktory.

Úkol č. 3 – Identifikace Pasteurellaceae a jejich přesnější určení (2)
}3c) Detekce kapsulárních antigenů H. Influenza: Koaglutinace = reakce se stafylokokem à aglutinát
byl hustší díky navázání stafylokoka na Fc konec protilátky proti hemofilovi.
}
}3d) Detekce P. multocida pomocí
•typického vzorce citlivosti:
•citlivost na penicilin a
•rezistence k vankomycinu à rod Pasteurella.
•
}

Úkol č. 4 – Hajnova půda
}Zapište si, které kmeny fermentují glukózu a které ne.
§štěpení laktózy (A = negativní, B = pozitivní)
§štěpení glukózy (C = negativní, D = pozitivní)
§produkce H2S (pozitivní = zčernání půdy)
§tvorba plynu (pozitivní = potrhaná půda,
•bublinky, půda vysunutá nahoru)
•
•

Úkol č. 5 – Určení G– glukózu nefermentujících bakterií a G– koků (1)
}5a) Oxidázový test:
§GNFB: Pseudomonas je vždy pozitivní, Burkholderia většinou pozitivní, Stenotrophomonas bývá
zpravidla negativní. Oxidáza pozitivní bakterie s typickou vůní a pigmentem (zpravidla zeleným,
řidčeji modrým či zrzavým) je prakticky s jistotou Pseudomonas aeruginosa (není nutno provádět
biochemii 5a
•
§

Úkol č. 5 – Určení G– glukózu nefermentujících bakterií a G– koků (2)
}5b) Podrobné biochemické testování:
• NEFERMtest 24:
}Tvorba kódu:
§První číslice je 0 (oxidáza negativní) nebo 1 (oxidáza pozitivní).
§Dalších 6 číslic pochází ze sloupců H až C.
§Sloupce A a B se nepočítají (používají se jen pro případné další rozlišení.
§Jedna destička – 4 kmeny po třech řádcích, pro každý kmen 24 reakcí.
•
•
•
}
}
§

Úkol č. 6 – Testy citlivosti patogenů na antibiotika
}6a, b, c): Odečtěte difúzní diskový test pro kmen určený jako Haemophilus influenzae, pasterela a
pseudomonáda. }6d): Kontrola primárních rezistencí u kmenů burkholderie a stenotrofomonády – pouze
na bočním stole.

Úkol č. 7 – Vztahy bakterií ke kyslíku
}Porovnejte růst bakterií v bujónech (masopeptonový a VL bujón) kultivovaných za aerobních a
anaerobních podmínek
•
}GNFB jsou striktně aerobní
}Enterobacteriaceae fakultativně anaerobní
}Anaeroby striktně anaerobní
}

Po tomto cvičení byste měli znát:
}G- tyčinky čeledi Pasteurellaceae – hemofily, pasterely: význam, diagnostika, léčba }GNFB –
pseudomonády, rody Acinetobacter, Burkholderia a Stenotrophomonas: význam, diagnostika, léčba