G- koky praktikum č. 6 Lékařská mikrobiologie – cvičení Mikrobiologický ústav LF MU http://leganerd.com Obsah cvičení }G- koky a ostatní G- tyčinky §Charakteristika, význam, léčba §Diagnostika } G- koky – rod Neisseria (1) }Kultivačně náročné G- koky až kokotyčky: §Ústní neisserie: běžný krevní agar §Meningokok: obohacený krevní agar §Gonokok: čokoládový agar } Často se vyskytují jako diplokoky. }Kataláza i oxidáza pozitivní. }Aerobní / mikroaerofilní. Některé druhy mohou vyžadovat zvýšenou tenzi CO2. } G- koky – rod Neisseria (2) }Neisseria gonorrhoeae (gonokok): §Původce kapavky – klinické projevy: zánět uretry a u žen také zánět cervixu, výskyt také ve faryngu a rektu. U žen se nejedná o zánět pochvy à na test na kapavku se neprovádí výtěr z pochvy! §Onemocnění nezanechává trvalou imunitu à není možné očkování. §Kredeizace = prevenze novorozenecké keratokonjunktivitidy (Septonex, dříve AgNO3). • • G- koky – rod Neisseria (3) }Neisseria meningitidis (meningokok): §Způsobuje meningitidy, ale také sepse – vždy se jedná o klonální kmeny. Míra virulence souvisí s proteinovými antigeny. Polysacharidové antigeny určují především to, zdali lze infekci kmenem předejít očkováním. §Meningitidy málo časté, ale vysoce letální s velmi rychlým průběhem z plného zdraví chřipkovité příznaky, vyrážka, petechie, meningeální příznaky, sepse) §Přenos: těsný kontakt. Vzniku infekce napomáhá narušená sliznice, oslabený organismus. §U nás vzácný výskyt ve srovnání s hlavně středoafrickými zeměmi. • G- koky – rod Neisseria (4) }Léčba meningitidy: §Zajištění základních životních funkcí – hlídání krvácení a acidobazické rovnováhy. §Okamžité podání ATB – lék volby = klasický penicilin. §Další ATB: cefalosporiny 3.generace (ceftriaxon – dobrý průnik do likvoru). }Očkování: §Nízká incidence v Evropě – neočkuje se celá populace, ale pouze rizikové skupiny. §Problém: seroskupina B à slabá Ag determinanta. Dnes existuje univerzální vakcína, ale s nejistou účinností. §Vakcíny: staré polysacharidové chrání hůře než nové konjugované. Rozdíly také v seroskupinách (samotně C, A + C nebo tetravakcína A + C + W135 + Y). V Česku nejběžněji B a C. Různé serotypy rodu Neisseria G- koky – rod Neisseria (5) }Ústní neisserie: §Běžná mikroflóra dutiny ústní a faryngu. §Obyčejně nepatogenní, při poruše imutiny endokarditidy, meningitidy. §Koky, kokobacily, méně často ve formě diplokoků. §Růst možný na neobohaceném krevním agaru. Srovnání zástupců rodu Neisseria G- koky – rod Moraxella }Moraxella (podrod Branhamella) catarrhalis: §Přítomna i u zdravých osob ve faryngu. §Jako čistá kultura způsobuje sinusitidy, otitis media, faryngitidy a podobně. §Moraxella catarrhalis §Kataláza, oxidáza •INAC pozitivní Další G- tyčinky – Legionella pneumophila }Legionella pneumophila způsobuje legionářskou nemoc (těžší varianta) nebo Pontiackou horečku (lehčí varianta nepostihující plíce). }Rezervoár: vodovody, klimatizace, atd. } Další G- tyčinky – rod Bordetella }B. pertussis a B. parapertussis: původci černého kašle – velice vzácný díky očkování. Jako odběrový materiál se používá pernasální výtěr (=odběr z nosohltanu bez dotyku okolních sliznic). }B. bronchiseptica: původce různých patologických stavů člověka a zvířat. Další G- tyčinky – rod Brucella }Klasický původce zoonóz. }Brucella abortus: kraví patogen. Napadá hovězí placenty, způsobujíc zmetání (potraty) skotu. U lidí způsobuje Bangovu nemoc (vstupem je poraněná kůže, horečka, orgánová postižení atd.) }Brucella suis: prasata }Brucella melitensis: ovce }Brucella canis: psi Další G- tyčinky – rod Francisella }Nejdůležitějším druhem je Francisella tularensis: §Tularémie = zaječí mor. Ohrožené skupiny: myslivci, kuchaři pracující se zvěřinou. §Napadá rány, ale je možné ji tak vdechnout à zápaly plic. Diagnostika G- koků (1) }Neisseria gonorrhoeae: zásadní je správný odběr. Velice citlivý patogen, který často nepřežije převoz à doporučování je poslat také nátěr na sklíčko z cervixu a urethry (avšak ne z rekta a faryngu) }Komplexní vyšetření na kapavku tedy zahrnuje: §výtěr z urethry na Amiesovu půdu + nátěr §výtěr z cervixu (ženy) na Amiesovu půdu + nátěr §výtěr z rekta na Amiesovu půdu (bez nátěru) §výtěr z faryngu na Amiesovu půdu (bez nátěru) Diagnostika G- koků (2) }Neisseria meningitidis – purulentní meningitida: §Odběr mozkomíšního moku – vyšetření biochemicky, cytologicky, mikrobiologicky. §Při odběru: likvor je zkalený, vytéká pod tlakem. §V laboratoři: mikroskopie (G- diplokoky tvaru kávového zrna, často intrecelulárně lokalizované), přímý průkaz antigenu §Nejdůležitější je okamžité zahájení léčby! Nátěry kapavky Diagnostika G- koků (3) •Neisserie a moraxelly: }Kultivace: drobné, bezbarvé nebo nažloutlé (podle druhu) kolonie, rostoucí (podle druhu) na krevním či čokoládovém agaru. §Gonokoky: rostou jen na čokoládovém agaru §Meningokoky: rostou na bohatších krevních, ale samozřejmě i na čokoládových agarech §Ústní neisserie a M.catarrhalis rostou na chudém i bohatém krevním agaru i na čokoládovém agaru }Krevní agar či čokoládový agar je nezbytný i pro difusní diskový test. Diagnostika G- koků (4) •Neisserie a moraxelly: }Biochemie: kataláza pozitivní, oxidáza pozitivní (Moraxella může mít opožděnou reakci); Moraxella catarrhalis pozitivní ve specifickém testu, zvaném INAC (indoxylacetátový test). }Pozn. U INAC testu se postupuje jako u oxidázy, ale proužek je nutno zvlhčit a je nutno pět minut počkat. Zbarvení je modrozelené. • }Antigenní analýza: zpravidla prováděná jako latexová aglutinace, velmi důležitá u meningokoků k určení seroskupiny. Druhové určen neisserií }Biochemické testy: zpravidla NEISSERIAtest, v jiných zemích jiné testy. }Poměrně malá biochemická aktivita: gonokok štěpí jen glukózu, meningokok jen glukózu a maltózu. Diferenciální diagnostika: neisserie a moraxelly (1) }Gramovo barvení: G- (diplo)koky }Oxidáza (pozitivní) rozlišuje některé jiné G- koky (např. acinetobaktery ze skupiny G- nefermentujících bakterií jsou také kokoidní) }Růst na různých půdách rozliší §gonokoky (rostou jen na čokoládovém agaru), §meningokoky (rostou na bohatších krevních, ale samozřejmě i na čokoládových agarech) §ústní neisserie (rostou na chudém i bohatém krevním agaru i na čokoládovém agaru) §M. catarrhalis (růst jako u ústních neisserií) Diferenciální diagnostika: neisserie a moraxelly (2) }INAC test (proužkový test podobný oxidázovému) – pozitivní u Moraxella catarrhalis. }Komplexní biochemický test (NEISSERIAtest) se používá hlavně k vzájemnému rozlišení ústních neisserií. }Antigenní analýza (určení seroskupiny meningokoků u invazivních infekcí). Diagnostika jiných G- tyčinek }Mikroskopie: G- tyčinky, často krátké }Kultivace: zpravidla speciální půdy (BG = Bordet Gengouva pro bordetely, BCYE pro legionely atd.) }Biochemická identifikace: některé znaky mohou být využity }Antigenní analýza: někdy užitečná }Nepřímé metody se využívají, nejčastěji u tularémie }Diferenciální diagnostika tu neprobíhá algoritmicky. }Zpravidla jsou vzorky zasílány na vyšetření přímo s podezřením na legionelózu, dávivý kašel, Bangovu chorobu apod. Speciální očkování bordetel BCYE půda pro legionely Úkol č. 1 – Mikroskopie }1a) Mikroskopujte uretrální nátěr kapavky, vše zakreslete (diplokoky, leukocyty). }1b) 4 kmeny G- koky, jeden G+. }Obarvěte podle Grama 12 podezřelých kmenů (pro zopakování: natřít à nechat uschnout à fixovat plamenem à poté barvit: Gram 30 s à Lugol 20-30 s à opláchnout vodou à alkohol 15-20 s à opláchnout vodou à safranin 60 à opláchnout vodou à osušit filtračním papírem (nedrhnout buničinou ani ničím jiným!) à imerzní objektiv - olej) Intracelulární uložení gonokoků Úkol č. 2 – Kultivace na agarových půdách }Popište nárůst kolonií na KA, ty které zde nerostou popište na čoko agaru (jeden kmen). }Neobohacený KA: ústní neisserie, moraxelly }Obohacený KA: ústní neisserie, moraxelly, meningokok }Čoko agar: ústní neisserie, moraxelly, meningokok, gonokok • Úkol č. 3 – Základní biochemické testy }Pouze demonstračně na bočním stole!!! • }3a) Oxidázový test k odlišení neisserií a moraxel od případných jiných G- koků. }3b) Indoxylacetátový test k odlišení Moraxella catarrhalis • od neisserií. Úkol č. 4 – Určení G– glukózu nefermentujících bakterií a G– koků (2) • NEISSERIAtest: }Jeden řádek – 1. jamka = negativní kontrola. Test začíná od 2. jamky!!! }Nutno zakápnout Lugolovým roztokem před provedením odečtu (nemusíte dělat). §Gonokok štěpí glukózu §Meningokok štěpí maltózu •a glukózu • • } } § Úkol č. 5 – Testy citlivosti patogenů na antibiotika }Odečtěte difúzní diskové testy pro gonokoka a meningokoka. }Test pro Moraxellu se vzhledem k hraničním citlivostem neprovádí. Úkol č. 6 – Přímý průkaz Ag původců meningitid v mozkomíšním moku }6a) Demonstrace soupravy k latexové aglutinaci } } } } } } } }6b) Videoklip Úkol č. 7 – Diagnostika bordetel, brucel, legionel a francisel (1) }7a: Kultivační diagnostika bordetel: BG = Bordet Gengouva } }7b: Demonstrace kultivační •půdy na legionely: BCYE } • } } Úkol č. 7 – Diagnostika bordetel, brucel, legionel a francisel (2) }7c: Průkaz protilátek proti •tularémii: odečte se titr •s nejvyšší pozitivní reakcí. Zde •jakýkoliv titr = pozitivní •reakce! } } Úkol č. 7 – Diagnostika bordetel, brucel, legionel a francisel (3) }7d: Diagnostika protilátek proti brucelóze: §Akutní infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně IgM i IgG. §Pacient po prodělané infekci: malé množství protilátek, pouze IgG (imunologická paměť). §Chronická infekce: různé možnosti podle aktivity infekce, mikrobiálního druhu apod. • } Po tomto cvičení byste měli znát: }G- koky: neisserie, moraxelly, brucelly, legionelly, franciselly – nejvýznamnější zástupci, jejich diagnostika a léčba. Rozdíly v použitých kultivačních půdách!