Jméno: Charvátová Lucie, Ihnátová Markéta, Souralová Tereza
Datum: 4. 10. 2016
PROTOKOL Č. 4
Název úlohy: Konjugace kmenů Escherichia coli Hfr a FStudovaný
předmět: Escherichia coli HfrH Reich (donor), Escherichia coli F-
28R801
(recipient)
Materiál: PNS bujón, MPA, MA (koncentrovaný roztok solí, 20% glukóza, streptomycin,
thiamin)
Princip metody:
Po kontaktu dvou buněk a vytvoření konjugačního můstku může být mezi těmito buňkami
přenesena DNA (z donorové buňky do recipientní). V důsledku toho vznikají rekombinanty
s..novými vlastnostmi.
V našem pokusu jsme smíchaly kulturu donorového a recipientního kmene a následně
nechaly inkubovat. Během této inkubace jsme založily misky ke stanovení titru donorového
kmene (k vyjádření frekvence rekombinantů) a jiné misky ke zjištění, zda ani jeden
z..použitých kmenů neroste na selektivní půdě.
Výsledkem pokusu je tedy zjištění frekvence rekombinant, které narostly na selektivní půdě,
na které by nemohl růst ani donorový ani recipientní kmen.
Fotografie:
Obr. 1: Kontrolní misky (ověření, že ani jeden kmen neroste na selektivní půdě)
Výpočty:
Množství složek C, D a E přidaných k MA:
Složka A (vodní agar)... 180 ml
Složka B (roztok solí)... 60 ml
Složka C (glukóza)... 2,5 ml -> glukózy se přidávalo 1 ml do 100 ml MA -> přidali jsme 2,5
ml glukózy, z toho lze odvodit, že počítáme s celkovým objemem směsi 250 ml
Složka D (streptomycin) … přidat do konečné koncentrace 100 µg/ml, přičemž zásobní
roztok má koncentraci 100 mg/ml -> naředit 1000x -> do objemu 250 ml přidáme 250 µl
zásobního roztoku streptomycinu
Složka E (thiamin) … přidat do konečné koncentrace 5 µg/ml, přičemž zásobní roztok má
koncentraci 50 mg/ml -> naředit 10 000x -> do objemu 250 ml přidáme 25 µl zásobního
roztoku thiaminu
Titr donorového kmene Hfr:
hodnoty stanoveny z ředění 10-5
:
(112+94+116)/3 = 107,33·105
CFU/100 µl = 1073,3·105
CFU/ml = 1,07·108
CFU/ml
Počet konjugantů:
1) Na miskách, kde jsme pipetovali 0,1 ml -> 5, 7, 15
(5+7+15)/3 = 27 konjugantů/100 µl = 270 konjugantů/ml
2) Na miskách, kde jsme pipetovali 0,2 ml -> 36, 40, 31
(36+40+31)/3 = 35,6 konjugantů/200 µl = 178,3 konjugantů/ml
Frekvence rekombinantů: počet konjugantů/titr donorového kmene Hfr
178,3 konjugantů/1,07·108
CFU = 166,6·10-8
= 1,6·10-6
Diskuse a závěr:
Potvrdily jsme, že podle očekávání ani jeden z používaných kmenů neroste na selektivní
půdě. Kmen Escherichia coli HfrH Reich, tedy náš donor, je senzitivní ke streptomycinu a
proto neroste na půdě s obsahem tohoto antibiotika. Kmen Escherichia coli F-
28R801, náš
recipient, na této půdě rovněž neroste, neboť tento kmen je deficientní v genech pro syntézu
základních aminokyselin, a proto není schopen růst na minimálním agaru bez přídavku těchto
aminokyselin.
V samotném provedení konjugace jsme byly úspěšné - frekvence vzniklých rekombinantů
činila 1,6·10-6
. Pokud bychom tuto frekvenci měly srovnat s transdukcí menšího plazmidu
(pT181), který byl přenášen s frekvencí v řádu 10-5
, pak je to méně úspěšný proces.
Transdukce většího plazmidu (pHOUMR-like) však probíhala s frekvencí v řádu 10-8
, což
činí naopak konjugaci více úspěšnou.